α-突觸核蛋白促進原代神經元及轉基因小鼠神經細胞表面NMDA受體的內在化

陳予東 楊巍巍 李 昕 王 鵬 李旭冉 于 順

(首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室北京市老年病醫療研究中心分子診斷實驗室教育部神經變性病重點實驗室，北京100053)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是一種由 144個氨基酸構成的酸性可溶性蛋白，主要存在于神經元突觸前末梢［1］。α-Syn與神經退行性病變密切相關，在帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)患者腦組織的路易體中(Lewy body，LB)［2-4］，肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者細胞內包涵體中［5-7］均能檢測到α-Syn存在。但是α-Syn如何參與這些神經退行性病變的病理生理過程目前尚不明確。

α-Syn可分泌到細胞外［8］，而胞外 α-Syn可通過內吞相關蛋白-Rab5B［9］的介導快速進入細胞。鑒于Rab5B也參與N-甲基D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的內在化，且文獻［10-11］表明 α-Syn在多巴胺能神經細胞中促進NMDA受體內在化，因此本研究目的是在原代神經元及轉基因動物水平上，觀察α-Syn對NMDA受體的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

健康C57/B6新生鼠，鼠齡0～12 h，野生型C57/B6鼠，18～22 g，由中國軍事醫學科學院動物中心提供(實驗動物許可證號:SCXK-2014-004)。轉α-Syn C57/B6小鼠，體質量18～22 g，由中國醫學科學院動物中心提供(實驗動物許可證號:SYXK:2014-0039)。杜恩斯組織勻漿器 (Wheaton Kimble公司，美國)。NMDA(Sigma公司，美國)，Neurobasal培養基 (Gibco公司，美國)，B27(Gibco公司，美國)，DMEM培養基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(FCS)(Berlin公司，美國)，NMDAR NR1抗體 (Abcam 公司，英國)，DAPI(Sigma公司，美國)，Rab5B抗體 (Santa Cruz公司，美國)，Rab5B反義寡核苷酸 (百維恩公司，中國)，BCA蛋白質定量試劑盒(Pierce Biotech公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 重組人α-Syn的制備

將人α-Syn cDNA插入表達載體pET。然后將pET-α-Syn轉化至BL21(DE3)感受態細胞，在含氨芐西林的2%YTA培養液中培養，加IPTG誘導基因重組蛋白表達。所表達的基因重組型α-Syn采用離子交換層析和反向層析法純化。BCA法定量純化后的α-Syn。

1.2.2 海馬神經元原代培養

冰上斷頭取出C57/B6新生鼠雙側海馬，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，用DMEM培養基(90%DMEM+10%胎牛血清)終止消化。玻璃滴管火焰拋光后，輕柔吹打。用DMEM培養基稀釋成5×105/mm3的密度接種到直徑35 mm多聚賴氨酸包被的培養皿，置于37℃，5%CO2的培養箱內。2 h后，顯微鏡下觀察神經元貼壁后，改用Neurobasal、B27無血清培養基繼續培養箱內培養。以后每3 d換液一次，培養10～12 d左右用于實驗。

1.2.3 Rab5B反義寡核苷酸

Rab5B反義寡核苷酸(antisense sequence，AS)及擾亂順序的寡核苷酸(scrambled sequence，SS)包被的慢病毒且攜帶GFP蛋白由中國百維恩公司采購，其序列分別為:5'-GCTGTGCTTCTGCTAGTCAT-3'和 5'-GGGTTCGTTTCTC-TCAGTCA-3'。

1.2.4 細胞免疫熒光檢測

按照實驗分組，向海馬神經元培養基中添加攜帶GFP-AS及GFP-SS的慢病毒，繼續培養72 h，部分神經元培養基中添加α-Syn(10 μmol/L)，37℃孵育1 h。細胞用PBS輕輕漂洗后，用預冷的4%多聚甲醛固定細胞30 min，1%BSA封閉1 h。將細胞與抗NMDAR NR1單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、抗Rab5B單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，于4℃反應過夜，然后與FITC標記的山羊抗鼠IgG，山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)反應2 h。熒光共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.2.5 蛋白提取物的制備

1)腦勻漿蛋白提取:將野生型及轉α-Syn C57/B6小鼠處死后，剝離雙側海馬體至杜恩斯組織勻漿器，加入適量蛋白裂解液(總蛋白裂解液或膜蛋白裂解液)勻漿，全程均在冰上操作。將腦組織勻漿15 000 g，1 h，4℃離心，上清即為總蛋白或膜蛋白，BCA法定量。

2)細胞蛋白提取:培養10～12 d的海馬神經元用預冷的PBS洗2遍后加入蛋白裂解液(總蛋白裂解液或膜蛋白裂解液)，15 000 g，1 h，4℃離心，上清即為總蛋白或膜蛋白，BCA法定量。

1.2.6 Western blotting分析

7.5 %及12.5%的SDS-PAGE電泳分離蛋白質，半干法將蛋白質轉移至 PVDF膜。PVDF膜與NMDAR NR1單克隆抗體(1∶1 000)，Rab5B抗體(1∶1 000)于4℃反應過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫反應1 h，ECL試劑盒檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 α-Syn促進原代海馬神經元膜蛋白NMDAR1內在化

免疫熒光技術觀察原代海馬神經元胞膜的NMDAR NR1分布表達狀況。如圖1所示，正常培養的海馬神經元中多數NMDAR NR1定位于細胞膜，少量位于細胞質。而 α-Syn預處理后，神經元多數NMDAR NR1定位于細胞質，發生內在化。

圖1 α-Syn對原代神經元細胞表面NMDAR NR1的影響Fig.1 Effect of α-Syn on cell surface NMDAR NR1 expression in primary neurons

2.2 轉α-Syn基因小鼠海馬神經元中NMDAR NR1內在化增多

抽提野生型與轉α-Syn C57/B6小鼠海馬細胞質及全細胞蛋白行Western blotting分析，結果如圖2A所示，轉基因小鼠全細胞中含有較高的α-Syn水平。如圖2B所示，轉α-Syn C57/B6小鼠膜蛋白組分中NMDAR NR1較野生型小鼠降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，而全細胞蛋白組分中2組小鼠NMDAR NR1并無顯著變化。圖2C結果顯示，轉α-Syn C57/B6小鼠中Rab5B蛋白表達較野生型小鼠顯著增高，且二者差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 Rab5B蛋白參與 α-Syn促進NMDAR NR1的內在化

如圖3所示，外加α-Syn可促進NMDAR NR1下膜，而應用Rab5B反義核苷酸處理原代海馬神經元后，可消除α-Syn促進NMDAR NR1內在化的作用。

圖2 轉α-Syn基因小鼠海馬神經元中NMDAR NR1內在化增多Fig.2 Increased NMDAR NR1 internalization in hippocampal neurons of α-Syn transgenic mice

圖3 抑制Rab5b表達對α-Syn引起的細胞表面NR1下調作用的影響Fig.3 Effects of Rab5b suppression on α-Syn-induced surface NR1 reduction

3 討論

筆者發現在原代神經元及轉基因動物水平，α-Syn仍然使神經細胞表面NR1表達減少，但不改變總的NR1表達量。NR1是NMDA受體的重要亞單位，其數量減少提示NMDA受體數量的減少。α-Syn減少細胞表面NR1而不改變總NR1表達量提示，α-Syn很可能通過引起NMDA受體內在化而下調細胞表面NMDA 受體含量［11］。

NMDA受體的內在化是通過內吞機制實現的［12］。有證據［13］表明，NMDA 受體的內吞受 Rab5B介導，因此推測，Rab5B可能參與了 α-Syn引起的NMDA受體內吞。為了證明Rab5B在α-Syn介導的NMDA受體內在化中起作用，本研究觀察了α-Syn對Rab5B表達的影響，結果發現在細胞及動物水平，α-Syn均可上調Rab5B，并且其小干擾RNA可阻斷α-Syn對NMDA受體的作用。以上結果均表明α-Syn是通過調節內在化相關蛋白Rab5B促進NMDA受體內在化。

NMDA受體廣泛參與神經退行性疾病患者的興奮性神經元損傷并引起其認知功能障礙。α-Syn對NMDA受體內在化的調控對揭示上述患者興奮性神經元損傷并導致認知功能障礙起重要作用。

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