元寶楓葉提取物的安全性毒理學研究

高麗芳 曹麗歌 田 蜜 胡子凈 郜 文

(首都醫科大學食品藥品安全評價中心，北京100069)

元寶楓(acer truncatum Bunge)為槭樹科槭樹屬的落葉喬木，因翅果形狀像中國古代金錠“元寶”而得名。元寶楓葉提取物成分復雜［1-4］，主要成分為植物多酚及黃酮，是一種新型的脂肪酸合酶抑制劑(fatty acid synthase，FAS)，研究［5-7］已經證實其具有抗腫瘤［5，8］、減肥［9］、抗菌［1-2，10］、抗氧化［11］、抑制小膠質細胞從而抗神經炎性［12］，抑制破骨細胞激活［13］等作用。本實驗對元寶楓葉提取物進行急性毒性、遺傳毒性及亞慢性毒性研究，為其食用安全性提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

元寶楓葉提取物(acer truncatum bunge leaves extract，AT)由北京首醫藥物研究所提供。元寶楓葉經粉碎后，用60%乙醇溶液在50℃下反復浸提2次。合并浸提液，在50℃下減壓濃縮，真空干燥成粉末，得到提取物。主要功效成分為植物多酚及類黃酮。90 d喂養實驗采用摻入飼料法，急性毒性試驗及遺傳毒性實驗，受試物采用無菌蒸餾水配制，現配現用。

1.2 實驗動物及環境

實驗動物，SPF級ICR小鼠和Wistar斷乳大鼠，實驗動物合格證號:SCXK(京)2010-0009，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。首都醫科大學實驗動物部提供動物實驗室，合格證號:SYXK(京)2010-0022，室內溫度(22±2)℃，相對濕度(50±20)%。實驗小鼠5只同籠飼養，喂飼塊狀飼料。實驗大鼠，懸掛式不銹鋼籠具單籠喂養。喂飼粉狀基礎飼料(北京科澳協力飼料有限公司提供真空包裝無菌飼料，合格證號:SCXK(京)2009-0012。動物試驗均經過首都醫科大學倫理審查委員會認可。

1.3 菌株

鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102 4個菌株，由國家北京藥物安全評價中心惠贈。4株菌株的5個遺傳特性經測定都達到規定標準。

1.4 主要儀器及試劑

CA800血細胞分析儀，血細胞分析儀所用稀釋液、溶血素、鞘液、清洗液等均使用儀器配套試劑。日立7180全自動生化分析儀，所用均為羅氏試劑。Leica DM1000型生物顯微鏡。

1.5 實驗方法

采用最大耐受量法，灌胃給予元寶楓葉提取物的劑量為10 g/kg(本文劑量均按每千克體質量所攝入的克數計算)。灌胃前禁食16 h。灌胃后連續觀察2周，并記錄動物中毒癥狀及死亡情況，結果判定參照GB 15193.3-2003［14］。

1.5.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

18～22 g ICR小鼠50只，雌雄各半。以急性毒性試驗中元寶楓葉提取物的最大劑量10 g/kg為最高劑量，下設1/2(5.0 g/kg)及1/4(2.5 g/kg)2個劑量組，另設陽性對照組(環磷酰胺40 mg/kg)及陰性對照組，每組動物雌、雄各5只。經口灌胃給藥，灌胃量0.02 mL/g。連續灌胃受試物2 d(間隔24 h)于末次給藥后6 h，動物頸椎脫臼處死，取胸骨骨髓，按常規制片、染色、鏡檢。每只動物觀察1 000個嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，記錄含微核 PCE數，計算微核率(‰)。觀察嗜多染紅細胞與成熟紅細胞(PCE/NCE)，作為細胞毒性指標。結果判定參照GB 15193.5-2003［15］。

1.5.3 小鼠精子畸變試驗

18～22 g雄性ICR種SPF級小鼠25只。以急性毒性試驗中元寶楓葉提取物的最大劑量(10 g/kg)為最高劑量，下設1/2(5.0 g/kg)及1/4(2.5 g/kg)2個劑量組，另設陽性對照組(環磷酰胺40 mg/kg)及陰性對照組，每組動物5只。經口灌胃給藥，灌胃量0.02 mL/g。連續給予受試物5 d，于第1次給予后的第35天處死動物，取雙側附睪按常規制片染色和鏡檢，每只動物觀察1 000個精子，記錄畸變精子數，計算畸變率。結果判定參照GB 15193.7-2003［16］。

1.5.4 Ames試驗

采用平板預先溫浴法。預試驗顯示AT 5.0 mg/皿時有較明顯的抑菌現象，故選擇以1.0 mg/皿為最大劑量，以下設 0.2 mg/皿、0.04 mg/皿、0.008 mg/皿、0.001 6 mg/皿共5個劑量。另外設立空白對照，溶劑對照(DMSO)及陽性對照組。在加入S9體外代謝系統的情況下，2-AF作為 TA97a、TA98、TA100菌株的陽性對照物，10 μg/皿;2-AA 作為 TA102 的陽性對照物，12 μg/皿。在S9體外代謝系統缺失的情況下，芴酮作為TA97a、TA98 菌株的陽性對照組，0.2 μg/皿;MMS 作為TA100、TA102菌株的陽性對照物，1 μL/皿。試驗流程及結果判定參照 GB 15193.4-2003［17］。

學生的寢室都是二層鋪。壞學生為了省事，便站在二層鋪上往下尿尿。宿舍里一年四季總是臊氣熏天。不少學生的身上都長了那種很癢的濕疹。學生的行李件件都臟兮兮的。校方在宿舍管理方面一直顯得力不從心。宿舍管理員的外號叫“李嘆氣”。是啊，面對這種混亂的局面除了嘆氣還能干什么呢？

1.5.5 大鼠90 d喂養試驗

選60～80 g Wistar大鼠80只，雌雄各半。以人群推薦量(0.02 g/kg)的300、100和50倍設3個劑量組，即6 g/kg、2 g/kg及1 g/kg;另設陰性對照組(粉狀基礎飼料)共4組，每組動物雌、雄各10只。依大鼠體質量8%折算作為飼料攝入量，按劑量配制含不同元寶楓葉提取物濃度的飼料，即4.8%、1.6%、0.8%。摻入飼料，自由攝入。實驗持續90 d。實驗期間每日觀察動物的活動情況、毛色、攝食及排泄情況，癥狀及出現的時間，出現死亡時進行尸體解剖，肉眼觀察臟器的病理改變，有病理改變時作病理切片作組織學觀察。每周稱量體質量、飼料加入量及剩余量，計算食物利用率。實驗第45天時通過內眥采血進行血液學指標及生物化學指標測定，實驗結束時通過內眥采血方式測定血液學指標及斷頭采血方式測定生化指標。實驗結束時對大鼠行大體解剖觀察，取肝、脾、腎、睪丸或卵巢進行稱質量，計算臟器系數。同時，取高劑量組和陰性對照組20例(雌雄各半)，中低劑量組10例(雌雄各半)，心、肝、脾、胰、腎、胃、十二指腸、睪丸或卵巢進行常規制片、染片，光學顯微鏡下進行病理組織學檢查。數據處理和結果判定參照GB 15193.13-2003［18］。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析。數據以均數±標準差(±s)形式表示。微核試驗采用泊松分布統計方法進行數據處理，小鼠精子畸形試驗采用Wilcoson秩和檢驗統計方法進行數據處理。Ames試驗的結果判定以直接計數培養基上長出回變菌落數的多少而定，受試物組回變菌落數增加1倍以上，并有劑量反應關系或至少某一測試點有可重復的差異有統計學意義的陽性反應，即認為該受試物誘變試驗陽性。90 d喂養試驗采用單因素方差分析，首先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值＜F0.05，各組間均數差異無統計學意義，F值＞ F0.05，P＜0.05，則用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計，性別分開統計，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠經口急性毒性試驗

試驗期間未見小鼠出現中毒癥狀，無動物死亡。觀察期結束處死動物，大體解剖觀察未見異常。試驗結果顯示小鼠經口急性毒性試驗最大耐受劑量大于10 g/kg。據此判斷該受試物的急性經口毒性屬實際無毒級。元寶楓葉提取物經口急性毒性實驗對小鼠體質量影響，詳見圖1。

圖1 元寶楓葉提取物經口急性毒性實驗(10 g/kg)對實驗小鼠體質量影響Fig.1 Effect of AT leaves extract on body weights after oral administration(10 g/kg)in male and female mice

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

各受試組小鼠的微核率與陰性組相比，差異均無統計學意義，表明該受試物對小鼠的骨髓細胞染色體無斷裂損傷作用，詳見圖2。

2.3 小鼠精子畸變試驗

元寶楓葉提取物高、中、低劑量組、陰性對照組和陽性對照各組小鼠的精子畸形率依次為1.14%、1.12%、1.12%、1.14%和7.86%。各劑量組小鼠精子畸形率與陰性組比較，均差異無統計學意義(P＞0.05)。陽性對照組與陰性對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)。表明元寶楓葉提取物對小鼠生殖細胞無損傷作用。

圖2 元寶楓葉提取物對小鼠骨髓細胞微核發生率的影響(n=5)Fig.2 Effect of AT leaves extract after oral administration(10g/kg)on the incidence(‰)of micronucleated polychromatic erythrocytes(Mnpce，bar graph，left Y-axis)and the PCE/NCE(polychromatic/normochromatic erythrocyte)ratio(scatter curve，right Y-axis)in male and female mice

2.4 Ames試驗

TA97a、TA98、TA100和TA102 4株2種突變類型的菌株對元寶楓葉提取物進行5個劑量的試驗，在有代謝活化+S9或無代謝活化-S9系統的條件下，各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍，亦無劑量-反應關系，表明元寶楓葉提取物對4種突變株沒有明顯的誘導致突變作用，詳見圖3。

2.5 大鼠90 d喂養試驗

2.5.1 體質量、臟器質量和食物攝入量

雄鼠喂飼高劑量元寶楓葉提取物第3周結束后，體質量與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05，圖4)，而元寶楓葉提取物中、低劑量組動物實驗期間各周體質量與陰性對照組相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)。整個實驗期間各劑量組雌鼠體質量與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，大鼠體質量增長與元寶楓葉提取物無劑量反應關系。

喂飼高劑量元寶楓葉提取物的雄性大鼠在實驗第3周至第11周期間，每周食物攝入量顯著低于對照組(P＜0.05)，而中低劑量組動物實驗期間各周食物攝入量與陰性對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。整個實驗期間各劑量組雌鼠食物攝入量與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，大鼠每周食物攝入量與元寶楓葉提取物無劑量反應關系，詳見圖5。

3個劑量組動物食物利用率與陰性對照組相比未發現差異有統計學意義(P＞0.05，圖6)。

由表1可見，3個劑量組動物的各主要臟器質量和臟器系數與陰性對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖3 元寶楓葉提取物對TA97a、TA98、TA100和TA102菌株回復突變影響Fig.3 Effect of AT leaves extract on bacterial reverse mutation with(+S9mix)or without(-S9mix)metabolic activation.

圖4 元寶楓葉提取物對大鼠體質量影響Fig.4 Effect of AT leaves extract on mean weekly body weights at a 90-day oral toxicity study in male and female rats(±s，n=10)

圖5 元寶楓葉提取物對大鼠每周食物攝入量的影響Fig.5 Effect of AT leaves extract on mean weekly food consumption per rat at a 90-day oral toxicity study in male and female rats(x ± s，n=10)

圖6 元寶楓葉提取物對大鼠食物利用率影響Fig.6 Effect of AT leaves extract on mean weekly food efficiency at a 90-day oral toxicity study in male and female rats(x ± s，n=10)

表1 元寶楓葉提取物對大鼠臟器質量的影響Tab.1 Effects on organ weights in rats after 90 days of feeding (x ± s，n=10)

2.5.2 血液和生化指標

實驗第45天及實驗結束時，元寶楓葉提取物高、中、低劑量組動物的各項血液學指標與陰性對照組相比，差異均未無有統計學意義(P＞0.05)，詳見表2。

實驗中期第45天，元寶楓葉提取物高劑量組實驗動物空腹血糖值低于陰性對照組(P＜0.05)，其余指標未見異常，詳見表3。

2.5.3 病理組織學觀察

各組大鼠器官經光鏡組織學檢查總體觀察發現，部分標本可見中等量肝細胞體積縮小，胞質嗜酸性增強，但未見嗜酸小體形成，其中元寶楓葉提取物高劑量組雌性組變化較為明顯。各組心肌組織均見灶狀細胞胞質凝集、脾淤血、小腸黏膜層嗜酸性粒細胞浸潤，病變未隨劑量的增加而增加，考慮病變為動物本身問題。

表2 元寶楓葉提取物對大鼠血液常規的影響Tab.2 Effects of AT on hematology parameters in rats after 45 days and 90 days of feeding (x ± s，n=10)

表3 元寶楓葉提取物對大鼠血液生化的影響Tab.3 Effects of AT on clinical chemistry parameters in rats after 90 days of feeding (x ± s，n=10)

3 討論

元寶楓是集觀賞綠化、水土保持、特種用途等多種經濟、社會和生態效益于一身的重要樹種，日益受到人們的關注，對元寶楓開發利用也得到人們的重視。彭亮等人對元寶楓油的毒理學安全性實驗研究結果提示，元寶楓油未有急性、亞慢性和遺傳毒性［19］。元寶楓油作為新食品原料［國家衛生與計劃生育委員會(原衛生部):關于批準元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告(2011年 第9號)］［20］，已進入市場。本研究團隊已另文發表給予營養性肥胖模型大鼠元寶楓葉提取物30 mg/kg 3周后，與陰性對照組比較體質量、體脂質量和脂/體比均顯著降低(P ＜0.05)，且抑制脂肪酸合酶活性(P ＜0.05)［9］。但尚未發現有文獻對元寶楓葉提取物安全性毒理學進行詳細報道。元寶楓葉提取物作為天然來源的脂肪酸合酶抑制劑具有高效的特點，有很好的開發前景，因此對其食用安全性評價顯得尤為重要。

根據體外實驗及預實驗的結果筆者初步推算元寶楓葉提取物減肥作用的人群推薦量為1.2 g/d，按成人60 kg體質量計為1.2 g/d，因此在90 d喂養實驗中，設定人群推薦劑量的300，100和50倍，即1 g/kg，2 g/kg，6 g/kg，作為高、中、低 3 個劑量組別。本中心對元寶楓葉提取物的安全性毒理學實驗研究結果顯示:1)急性毒性試驗:經口最大耐受量高于10 g/kg(相當于推薦劑量500倍)。以急性毒性分級，屬于實際無毒物質。2)遺傳試驗:AMES試驗、小鼠骨髓微核試驗和小鼠精子畸變試驗結果均為陰性。3)90 d喂養試驗:結果顯示在1～2 g/kg，對實驗動物生長發育、食物利用率，血液系統、肝、腎功能、生殖系統以及蛋白、脂肪、糖的代謝無明顯影響。在6 g/kg時對雄性實驗大鼠體質量及進食量有影響(P＜0.05)，但不影響食物利用率;實驗中期45 d的空腹血糖低于陰性對照組(P＜0.05)，本研究認為這是元寶楓葉提取物藥理作用的放大，而不是毒性的表現。元寶楓葉提取物的降糖作用有待進一步研究。

［1］ Dong L P，Liu H Y，Ni W，et al.Four new compounds from the leaves of Acer truncatum［J］.Chem Biodivers，2006，3(7):791-798.

［2］ Dong L P，Ni W，Dong J Y，et al.A new neolignan glycoside from the leaves of Acer truncatum［J］.Molecules，2006，11(12):1009-1014.

［3］ Ma X，Tian W，Wu L，et al.Isolation of quercetin-3-OL-rhamnoside from Acer truncatum Bunge by high-speed counter-current chromatography［J］.J Chromatogr A，2005，1070(1-2):211-214.

［4］ 黃相中，潭理想，古昆，等.云南產元寶楓葉的化學成分研究［J］. 中國中藥雜志，2007，32(15):1544-1546.

［5］ Zhao W H，Zhang J F，Zhe-Wang，et al.The extract of leaves of Acer truncatum Bunge:A natural inhibitor of fatty acid synthase with antitumor activity［J］.J Enzyme Inhib Med Chem，2006，21(5):589-596.

［6］ 黎金龍，王耀楠，趙文華，等.微波輔助提取元寶楓落葉中的黃酮類物質以及脂肪酸合酶抑制劑［J］.中成藥，2007，29(8):1244-1248.

［7］ 樊媛潔，葉燕彬，郜文，等.元寶楓葉中有效成分的動態變化及對FAS抑制作用的研究［J］.中藥材，2010，33(11):1740-1743.

［8］ 李麗華，王熙才，邱宗海，等.云南元寶楓黃酮誘導個舊肺鱗癌細胞YTMLC凋亡的實驗研究［J］.腫瘤防治研究，2010，37(4):382-386.

［9］ 高麗芳，曹麗歌，田蜜，等.元寶楓葉提取物的減肥作用研究［J］. 衛生研究，2012，41(4):609-612.

［10］Kiss A K，Filipek A，Zyzynska-Granica B，et al.Effects of penta-O-galloyl-beta-D-glucose on human neutrophil function:significant down-regulation of L-selectin expression［J］.Phytother Res，2013，27(7):986-992.

［11］李志安，郭家智，劉承杏，等.楓葉黃酮對老年癡呆動物模型的抗氧化作用及分子機制［J］.神經解剖學雜志，2011，27(5):497-502.

［12］鐘蓮梅，宗一，戴紀男，等.元寶楓葉黃酮抑制脂多糖誘導的小膠質細胞激活的作用［J］.云南大學學報:自然科學版，2011，33(3):345-349.

［13］鄒智榮，宗一，陸地，等.楓葉黃酮抑制脂多糖誘導破骨前體細胞Raw264.7細胞激活的作用［J］.昆明醫學院學報，2012，33(2):4-8.

［14］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.3—2003急性毒性試驗食品安全性毒理學評價程序和方法［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［15］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.5—2003骨髓細胞微核試驗食品安全性毒理學評價程序和方法［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［16］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.7—2003小鼠精子畸形試驗食品安全性毒理學評價程序和方法［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［17］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.4—2003鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗食品安全性毒理學評價程序和方法［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［18］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB15193.13—2003 30天和90天喂養試驗食品安全性毒理學評價程序和方法［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［19］彭亮，楊峻鋒，覃輝艷，等.元寶楓油的毒理學安全性實驗研究［J］.中國食品衛生雜志，2011，23(1):70-75.

［20］中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，關于批準元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告(2011年第9號).［EB/OL］.［2011-03-29］.http://www.nhfpc.gov.cn/sps/s7891/201103/cffd9def6007444ea 271189c18063b54.shtml