新型Cervista酶切信號擴大法檢測高危型HPV用于宮頸癌篩查結果分析

趙婷婷，袁 亞，蔣舒平，涂煥平

(上海市普陀區人民醫院，上海200060)

宮頸癌的發生與多種因素相關，如病毒感染、宿主免疫狀況、基因特質性、環境因素、生活方式等［1］。目前認為HPV感染是宮頸癌的主要病因，90%以上的宮頸癌患者癌組織中可檢測到HPV［2］。目前宮頸細胞學檢查廣泛用于宮頸癌的篩查，但因檢測結果受宮頸病變位置深淺、細胞采集量及閱片經驗等影響，有時會造成假陰性結果［3］。2012年3月～2013年11月，我們將新型Cervista酶切信號擴大法(以下簡稱Cervista技術)用于高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測，現分析結果，探討其在宮頸癌篩查中的價值。

1 臨床資料

1.1 基本資料 3206例同期于我院行婦科檢查的婦女，年齡19～86歲，平均40.2歲。均行宮頸液基薄層細胞學檢查(TCT)及HR-HPV基因檢測。對細胞學異常、HR-HPV陽性患者行宮頸活檢。

1.2 檢查方法

1.2.1 TCT 按2004年TBS系統標準，診斷結論包括未見上皮內病變細胞或惡性細胞(NILM)、不能明確意義的非典型鱗狀細胞(ASC-US)、非典型鱗狀細胞不能除外高級別上皮內病變(ASC-H)、低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)和高級別鱗狀上皮內病變(HISL)及鱗狀細胞癌、腺上皮異常。

1.2.2 HR-HPV基因檢測 采用新型 Cervista技術。實驗材料:ThinPrep新柏氏制片，Cervista HRHPV檢測實驗試劑、儀器、耗材均來自美國Hologic(豪洛捷)公司。HR-HPV檢測與TCT細胞學檢測均來自同一樣本同一份細胞保存液。按構型采用三組寡核苷酸混合物進行14種HR-HPV檢測，其中A9 組檢測 16、31、33、35、52、58 型，A5/A6 組檢測51、56、66 型，A7 組檢測 18、39、45、59、68 型。DNA樣本提取及檢測參照試劑盒說明書，陽性者判為HR-HPV感染。

1.2.3 宮頸活組織檢查 對95例診斷為宮頸上皮內病變的患者進行隨訪及宮頸活組織檢查。按2010年WHO婦科腫瘤分類及診斷標準判定結果。統計其HR-HPV感染率。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行非參數檢驗χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCT細胞學診斷 3206例樣本中NILM 3031例(占94.54%)，ASC-US 93 例(占2.90%)，ASC-H 10例(占 0.31%)，LSIL43 例(占 1.34%)，HSIL29例，(占0.90%)。ASC-US及以上級別者共175例，占5.45%。

2.2 HR-HPV感染情況 3206例樣本中，HR-HPV陽性665例，感染率為20.74%;175例 ASC-US及其以上級別者 HR-HPV陽性121例，感染率為69.14%。HR-HPV感染率隨細胞學診斷級別升高而升高(χ2=8.00 ，P ＜ 0.05)。見表 1。HR-HPV A9、A5/A6、A7組感染情況:3206例樣本中，A9組感染403例，A5/A6組感染275例，A7組感染181例，感染率分別為 46.91%、32.01%、21.07%;A9組感染率最高。感染1個組529例、2個組89例、3個組 47例，感染率分別為 79.55%、13.38%、7.07%。NILM、ASC-US、ASC-H 、LSIL 、HSIL 者HR-HPV A9、A5/A6、A7組感染率差別有統計學意義(χ2=8.316，P ＜0.05)。見表 2。

表1 不同TCT診斷者HR-HPV感染情況比較

表2 不同TCT診斷者HR-HPV A9、A5/A6、A7組感染率比較

2.3 宮頸活檢診斷及HR-HPV感染率 95例患者宮頸活檢診斷為LSIL55例，HISL30例，鱗狀細胞癌10例，HR-HPV感染率隨病變級別升高而升高(χ2=6.37，P ＜0.05);A9 組感染率分別為 57.97%、67.50%、76.92%。見表 3。

表3 宮頸活檢證實的LSIL、HISL及鱗狀細胞癌者HR-HPV感染率比較

3 討論

TCT為一種簡便、無創的方法，是宮頸癌篩查的主要方法。目前臨床將TCT的TBS分類用于宮頸病變分級，協助臨床診療。婦女在一生中都可能感染HPV，80%以上感染可通過自身免疫調節清除［4］。低危型HPV主要引起生殖器疣，HR-HPV對評估異常宮頸細胞學結果具有重要價值［5］。少數HR-HPV持續感染后，其病毒基因可整合到宿主細胞 DNA，激活癌基因 E6、E7［6］，導致抑癌基因 P53、Rb等基因失活，誘導G1/S細胞周期分化異常、細胞無限增殖，導致宮頸癌的發生［7］。

目前，臨床及實驗中HPV檢測方法種類繁多。本研究采用新型Cervista技術檢測HR-HPV，初級反應為探針寡核苷酸、Invader寡核苷酸 與DNA目標序列結合進行切割，次級反應切割片段與熒光素標記的寡核苷酸結合，再與Cleavase酶識別結合，產生熒光放大信號［8］。其檢測 HR-HPV 的 L1、E6、E7區，每次檢測均設置人組蛋白Ⅱ基因特異的寡核苷酸作為內部質控，可消除因樣本量不足導致的假陰性結果;不與低危型HPV發生交叉反應，可避免假陽性結果。檢測中的外部質控(陰性對照和陽性對照)，保證每次結果準確性、特異性更高［8，9］。本組HR-HPV的感染率為20.74%，存在同時感染一組或多組病毒情況，說明個體差異、免疫狀態及對病毒的易感性各有不同。隨細胞學診斷分級升高，HRHPV感染率逐漸增高，說明高級別細胞學病變與HR-HPV感染關系最為密切。ASC提示為鱗狀上皮內病變的細胞改變，但從質和量上不足以作出明確診斷，分為 ASC-US、ASC-H，與 ASC-US相比，ASC-H的高級別鱗狀上皮內病變發生率較高。本研究ASC-H者HR-HPV感染率為70%，可認為HR-HPV陽性的ASC-H細胞可能更傾向于高度病變。

病理組織學檢查為宮頸病變診斷的金標準。本研究檢測結果表明，隨病理組織學級別升高，HRHPV感染率逐漸升高。結合細胞學和病理組織學診斷結果，表明HR-HPV感染與高級別上皮內病變、宮頸癌關系緊密，是導致宮頸癌發生的主要因素。Cervista技術按HPV構型分為三組，能檢測14種不同分組的HR-HPV，陽性結果表明DNA標本中至少存在一種HR-HPV。本研究各組HR-HPV感染率中，A9組構成比均為最高值。在中國HPV感染前三位是 HPV16、HPV52 及 HPV58［10］，其均包括在A9組中，說明HR-HPV A9組具有高致病性，導致宮頸癌的危險程度最高，對HR-HPV感染者、尤其是A9組持續感染者應引以高度重視，給予早期干預。

LSIL、HSIL、ASC-H患者具有高癌變風險，均應行陰道鏡檢查和宮頸活檢進一步明確診斷。按2011年子宮頸病變診斷與治療指南，對于年齡＞20歲的ASC-US者可采取以下處理方法，①HPV檢測和分流;②間隔6個月連續2次重復細胞學檢查;③行陰道鏡檢查［11］。對ASC-US的處理一直是宮頸病變規范治療的難點，存在因診療過度引起宮頸損傷、炎癥、增生，或認識不清導致治療不足、延誤診療的現象。HR-HPV檢測敏感性、特異性高，HR-HPVA9組具有高致病性，因此TCT、HR-HPV兩者聯合檢查能對ASC-US患者進行評估和分流篩檢，對早期發現宮頸癌及改善患者預后有重要意義。

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