糖尿病腎病患者血漿動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)研究

王衍慧，傅明捷，黃玉宇，李 靜

(廣州市第一人民醫(yī)院，廣州510180)

隨著人們生活水平提高、生活方式改變及社會(huì)老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)重，糖尿病(DM)發(fā)病率逐年上升，目前我國(guó)約有9 240萬(wàn)DM患者，已成為全球DM第一大國(guó)［1］。糖尿病腎病(DN)作為DM常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，是終末期腎病最常見(jiàn)的原因［2］，也是DM的重要致死、致殘?jiān)颉１狙芯坎捎脛?dòng)態(tài)血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，探討了DN與健康人群血漿差異蛋白表達(dá)，旨在為篩選DN血漿蛋白標(biāo)志物提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年10月～2013年10月住院的DN患者4例，均符合王海燕主編的《腎臟病學(xué)》(3版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)及1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。男2例、女2例，年齡56～62歲。選擇同期來(lái)自體檢中心的健康查體人群4例作為健康對(duì)照，男2例、女2例，年齡55～63歲。納入標(biāo)準(zhǔn):符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者;年齡18～80歲;血肌酐≤140 μmol/L;知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn):妊娠、哺乳期婦女;血肌酐＞140 μmol/L;合并原發(fā)性心血管、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病;合并嚴(yán)重感染等并發(fā)癥者。

1.2 方法

1.2.1 血清采集及處理 清晨空腹抽取兩組靜脈血10 mL，速凍存于液氮中，置于-70℃保存，備雙向電泳及質(zhì)譜分析用。

1.2.2 雙向電泳及質(zhì)譜分析

1.2.2.1 組織總蛋白抽提及蛋白質(zhì)測(cè)定 將血清以12 000 r/min，4℃離心30 min后，吸取上清入EP管，用50 mmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.5，取5 μL用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，其余上清置于-70℃保存?zhèn)溆谩２捎?D Quant Kit蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，其操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算直線(xiàn)回歸方程。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)熒光染料標(biāo)記 每組蛋白質(zhì)均取25 μg等量混合作為內(nèi)標(biāo)，50 μg內(nèi)標(biāo)蛋白用 400 pmol Cy2進(jìn)行標(biāo)記，分別以50 μg蛋白每400 pmol Cy3和400 pmol Cy5標(biāo)記，冰上避光放置30 min，再加1 μL亮氨酸(10 mmol/L)中止反應(yīng)10 min。

1.2.2.3 熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)和圖像掃描 50 μg Cy2、Cy3和Cy5標(biāo)記的樣品進(jìn)行混合，加等體積的2×樣品緩沖液(8 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，2%Bio-lyte pH 4～7，130 mmol/L DTT)，再加適量水化液(8 mol/L尿素，4%CHAPS，1%Bio-lyte pH 4～7，13 mmol/L DTT)補(bǔ)至總體積450 μL，上樣，30 V水化13 h，然后經(jīng)過(guò)100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，最后穩(wěn)定在8 000 V下進(jìn)行等電聚焦8.5 h。電泳后取出IPG膠條先后置入平衡A液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mmol/L 尿素，30% 甘油，1%SDS，0.2%DTT，痕量溴酚藍(lán))和平衡B液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mmol/L 尿素，30% 甘油，1%SDS，3% 碘乙酰胺，痕量溴酚藍(lán))中各平衡15 min。平衡后的膠條移至濃度12.5%PAGE分離膠上端用0.5%瓊脂糖封膠，2.5 W電泳30 min，然后以11 W恒功率電泳，直至溴酚藍(lán)指示線(xiàn)到達(dá)凝膠底邊處停止電泳。整個(gè)過(guò)程均避光操作。雙向電泳后，取出膠條擦洗干凈，輕置Typhoon掃描儀，以Cy2(488 nm激發(fā)激光和520BP40發(fā)射過(guò)濾器)、Cy3(532 nm激發(fā)激光和580BP30發(fā)射過(guò)濾器)和Cy5(633 nm激發(fā)激光和670BP30發(fā)射過(guò)濾器)設(shè)置進(jìn)行掃描，獲得分析使用的凝膠圖像。另需制作一塊制備膠，步驟同2D-DIGE，其上樣為1 000 μg內(nèi)標(biāo)蛋白，電泳后考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色用于差異蛋白的質(zhì)譜鑒定。

1.2.2.4 圖像分析 用DeCyder 5.0軟件分析2DDIGE圖像。首先對(duì)每一張膠圖上的所有蛋白質(zhì)點(diǎn)掃描進(jìn)行膠內(nèi)分析，對(duì)不同膠的同一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)與內(nèi)標(biāo)匹配，檢測(cè)每個(gè)點(diǎn)的容積(背景刪減后)、面積、峰值，計(jì)算每組(Cy3/Cy2，Cy5/Cy2)成像的標(biāo)準(zhǔn)豐度比值;然后對(duì)不同膠上的同一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)與內(nèi)標(biāo)匹配，進(jìn)行膠間分析，對(duì)匹配后每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)量進(jìn)行比較分析后確定差異蛋白，篩選分析圖像出現(xiàn)并比率≥1.5，P≤0.05的差異點(diǎn)。在制備膠上找到與分析膠上的差異點(diǎn)匹配的質(zhì)點(diǎn)，取點(diǎn)、脫色、酶解及樣品萃取，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，獲取肽質(zhì)量指紋圖譜及PKL文件，在NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)匹配。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SAS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，差異蛋白質(zhì)分析用One Way ANOVA方法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圖像分析 使用DeCyder5.0軟件分析，在每塊膠圖上檢測(cè)到蛋白斑點(diǎn)約1 300個(gè)。DN患者血漿與健康對(duì)照血漿比較，上調(diào)或下調(diào)1.5倍為截?cái)嘀担瑫r(shí)滿(mǎn)足P＜0.05的差異斑點(diǎn)有6個(gè)，見(jiàn)圖1。

2.2 差異表達(dá)蛋白鑒定 質(zhì)譜分析并通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProtKB/Swiss-Prot)比對(duì)鑒定出6種蛋白質(zhì)，分別為補(bǔ)體C3、C4、凝溶膠蛋白前體、纖維蛋白原γ、載脂蛋白E和細(xì)胞骨架蛋白16。見(jiàn)表1。

圖1 DN患者血漿差異表達(dá)蛋白質(zhì)分布峰度圖

表1 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

3 討論

DN的發(fā)病受多種因素影響，發(fā)病機(jī)制至今未完全闡明［4～6］。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作為一種全新的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，為揭示DN的病因病機(jī)提供了幫助［7］。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)表達(dá)水平、蛋白修飾與功能、蛋白之間相互作用等進(jìn)行高通量的篩選和分析，比傳統(tǒng)的單個(gè)基因研究或單個(gè)蛋白研究更能增加疾病診斷、預(yù)后判斷的可靠性，更能準(zhǔn)確反映機(jī)體的狀態(tài)［8，9］。本研究用蛋白質(zhì)熒光染料標(biāo)記DN及健康對(duì)照的蛋白質(zhì)，進(jìn)行2D-DIGE，并掃描獲得分析使用的凝膠圖像。對(duì)掃描后的熒光染料標(biāo)記分析膠圖像進(jìn)行圖像分析，分析后確定差異蛋白。

本研究成功構(gòu)建了2D-DIGE DN患者血漿蛋白圖譜，并分析鑒定出6種差異表達(dá)蛋白;質(zhì)譜分析并通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProtKB/Swiss-Prot)對(duì)比鑒定出6種蛋白質(zhì)，分別為補(bǔ)體C3、C4、凝溶膠蛋白前體、纖維蛋白原γ、載脂蛋白E和細(xì)胞骨架蛋白16，為進(jìn)一步篩選DN血漿蛋白標(biāo)志物提供依據(jù)。

補(bǔ)體C3是人體重要的免疫球蛋白，參與機(jī)體體液免疫激活過(guò)程，其分子量為195 kD，主要由巨噬細(xì)胞和肝臟合成，在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下，裂解成C3a和C3b兩個(gè)片段，在補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用。本研究中補(bǔ)體C3在DN患者與正常人群中呈現(xiàn)差異表達(dá)，提示其參與了DN的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，可作為DN的重要血漿分組標(biāo)志物［10，11］。載脂蛋白E是一種多態(tài)性蛋白，參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過(guò)程，其基因可調(diào)節(jié)許多生物學(xué)功能，與多種代謝疾病有關(guān)。近年研究顯示，載脂蛋白E與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)，在一定程度上可抑制機(jī)體過(guò)度免疫反應(yīng)，包括抑制T細(xì)胞的增殖與趨化，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞吞噬功能，從而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)［12，13］。本研究通過(guò) 2D-DIGE，發(fā)現(xiàn)DN患者與正常人群中載脂蛋白E存在表達(dá)差異，提示其可能參與了DN的發(fā)病過(guò)程，并可能作為其早期預(yù)警的分子標(biāo)志物［14，15］。

總之，本研究采用血漿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，應(yīng)用2D-DIGE，初步篩選出了DN與正常人群差異表達(dá)的血漿蛋白，為下一步進(jìn)行的前瞻性大規(guī)模臨床對(duì)照研究提供了一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。

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