PVA加門腔分流術對肝硬化大鼠肝臟組織中iNOS水平的影響

蔡潮農，方瑞君，李培平，張百萌，關曉東，李 堅

(1中山大學附屬第五醫院，廣東珠海519000;2北京師范大學珠海校區門診部)

門靜脈動脈化(PVA)在肝硬化門靜脈高壓癥及肝臟外科方面有良好的應用前景，但目前研究發現該技術尚存在一些問題，比如長期未加限流措施的動脈化或未行門靜脈分流的動脈化可能導致肝臟實質結構改變，包括門脈內膜纖維化、壞死性血管炎、肝實質纖維化等［1，2］。正常情況下，肝組織中主要表達內皮型一氧化氮合酶(eNOS)，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)無或僅有少量表達，后者在肝組織受到內毒素(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)及干擾素lp(IFN-lp)等細胞因子刺激后表達增加，活性可持續較長時間，催化NO大量持續產生，介導廣泛的毒性作用［1，3］。在氧化應激造成的肝損傷中，iNOS的表達與肝細胞壞死程度有關［4］。2012年11月～2013年12月，我們觀察了PVA加門靜脈分流術(PCS)對肝硬化大鼠肝組織中iNOS表達的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 模型建立與分組處理 健康雄性 Sprague-Dawley大鼠190只，體質量(250±20)g，SPF級，由中山大學實驗動物中心提供。參照文獻［5］采用純四氯化碳(CCl4)制作肝硬化模型，造模期間飲含100 mL/L乙醇的水溶液，造模期間死亡35只。按Ishak肝纖維化分級評分標準［6］達到肝硬化標準有139只。制模成功后，術前隨機抽10只肝硬化大鼠為對照，再隨機抽取40、40、20只，分別納入 A、B、C組。A組參考文獻［7～10］行PVA加PCS:利用大鼠右腎動脈、靜脈實現入肝門脈動脈化及門腔分流;B組只行PCS，采用門脈遠端與右腎靜脈吻合，近端門脈縫閉;C組為空白對照，僅行門脈阻斷+右腎切除，阻斷門脈時間依據A、B組動物阻斷門脈的平均時間，阻斷持續30 min。

1.2 肝組織iNOS表達檢測 術前及A、B組術后1、2、4、8周分別處死10只大鼠、C組術后相同時間點各處死5只大鼠。取肝臟組織，采用免疫組化SP法檢測肝細胞中的iNOS。光鏡下觀察iNOS陽性細胞胞質呈棕黃色，每張切片選取四周及中央5個區域，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析圖片胞質棕黃色顆粒面積、平均光密度(MOD)及累積光密度 (IOD，面積×平均光密度)，5張照片取均數，代表iNOS表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，檢驗數據的正態性和方差齊性符合條件后，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗;計量資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

三組術后各時點iNOS表達水平均低于術前(P均 ＜0.05)。A 組術后1、2、4 周 iONS表達高于 B、C組(P均＜0.01)，而術后8周，三組iNOS表達差異無統計學意義(見表1)。三組術前及術后不同時點iNOS表達變化趨勢見圖1。

3 討論

研究表明，PVA+PCS可顯著改善肝硬化大鼠肝功能及儲備功能，促進肝硬化大鼠肝組織細胞再生、增殖［9～12］，穩定入肝門靜脈的動脈血流［13，14］，在肝硬化門靜脈高壓癥的治療方面具有明顯優勢，同時對于肝移植、急性肝功能衰竭、手術難以切除肝門部腫瘤的手術治療也有廣闊的應用前景［15，16］。但目前也發現該技術存在的一些問題，如長期未加限流措施的動脈化可能導致肝臟實質結構改變，包括門脈內膜纖維化，肝實質纖維化，原因可能與肝臟前膠原蛋白ⅠmRNA表達上調，翻譯合成膠原蛋白增加有關［1，2］。

表1 各組肝組織iNOS相對表達量比較(±s)

表1 各組肝組織iNOS相對表達量比較(±s)

注:與術前相比，*P ＜0.05;與 A組同期相比，#P ＜0.01

組別 n iNOS A 組術前 10 600 583±32 828術后1周 10 560 372±35 878*術后2周 10 247 237±31 738*術后4周 10 407 727±39 964*術后8周 10 413 169±37 522*B組術前 10 600 583±32 828術后1周 10 221 381±39 341*#術后2周 10 271 642±37 357*#術后4周 10 383 416±37 588*#術后8周 10 354 977±37 586*C組術前 10 600 583±32 828術后1周 5 258 247±40 565*#術后2周 5 209 783±36 796*術后4周 5 321 239±39 596*#術后8周 5 287 126±30 730*

圖1 各組手術前后肝組織中iNOS表達變化趨勢(400×)

NOS至少有三種亞型，分別為eNOS、神經元型一氧化氮合酶(nNOS)和iNOS。肝臟內主要存在eNOS和iNOS兩種類型，eNOS存在于肝內血管和血竇內皮細胞中;iNOS則表達于肝細胞、Kupffer細胞和肝星狀細胞。在正常情況下，肝組織中主要表達eNOS，在許多物質如內毒素(LPS)、腫瘤壞死因了(TNF)及干擾素lp(IFN-lp)等細胞因子刺激后，iNOS呈誘導性表達增加，其活性可持續相當長時間，催化 NO大量持續產生，介導廣泛的毒性作用［1，2］。在氧化應激造成的肝損傷中，iNOS的表達水平與肝細胞壞死程度呈正相關，提示iNOS的活化及表達增強與肝臟損傷有關［4］。

我們建立了肝硬化大鼠模型，并采取不同措施處理，結果發現，各組大鼠術后肝組織中iNOS水平均低于術前造模成功時，提示iNOS高表達參與了肝硬化的形成。各組大鼠術后，隨時間推移，iNOS表達逐步下降，但A組下降幅度均B、C組緩慢，術后1～4周仍高于余兩組，至術后8周，三組iNOS表達達到谷值，組間差異無統計學意義。推測PVA技術是術后4周內A組大鼠肝組織iNOS高表達或下降緩慢的主要因素，與大鼠肝細胞損害密切相關。可能是PVA后，門靜脈處動脈血高壓灌注，為緩和PVA后的門脈高壓，有舒張血管平滑肌作用的化學分子如NO合成增加，而iNOS是合成NO重要的酶;而術后8周大鼠肝臟對PVA導致的血流動力學改變逐漸適應，PVA后門靜脈內徑、壓力、血流速度、血流量等指標處于高位的穩定狀態，iNOS生成減少，肝細胞損傷逐漸減輕。NO具有脂溶性，可直接彌散入鄰近血管平滑肌細胞中，引起血管平滑肌舒張，擴張血管，這一點與大鼠PVA后肝臟血流動力學的自限穩定性密切相關［12，13］。

綜上，PVA+PCS可上調肝硬化大鼠肝臟組織中iNOS的水平，但這種變化主要集中在術后4周內。4周后，肝臟對新的血流動力學改變適應并達到穩態，PVA造成的肝損害得到緩解。然而，本實驗結果還需遠期觀察進一步證實，PVA術后還應觀察門靜脈長期高壓血流灌注對肝臟微循環的不利影響，對肝間質纖維增生的影響等，并研究相應的預防控制措施。

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