醛糖還原酶基因多態性與2型糖尿病視網膜病變的關系

任 珉，趙莉莉，張 瑩，師 瑩，毛用敏，齊秀英

(1天津市心血管病研究所，天津300222;2天津市胸科醫院;3天津醫科大學公共衛生學院)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，是糖尿病患者視力受損和致盲的重要原因［1～4］。除高血糖和環境因素影響之外，遺傳因素在視網膜病變的發生發展中也起重要作用。醛糖還原酶(AR)是葡萄糖代謝多元醇通路上的限速酶，該酶基因表達異常與DR的發生發展密切相關［5］。既往對AR的研究多集中于其5'端的(AC)n核苷酸重復序列的多態性，近年來AR基因上游啟動區-106 C/T單核苷酸多態性開始受到關注。為探討AR基因上游啟動區-106 C/T單核苷酸多態性與DR發病的關系，我們于2009年6月～2011年3月進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年6月～2010年10月收治的2型糖尿病患者374例，均經1997年美國糖尿病協會(ADA)糖尿病診斷標準［6］確診。其中病例組 161例，男 84例，女 77例，年齡(59.93±10.68)歲，病程7～16年，有DR病史或住院期間眼底鏡檢查有視網膜病變，排除其他原因引起的視覺損害、視力下降;對照組213例，男114例，女99例，年齡(58.40±12.96)歲，病程2～12年，無 DR 病史且住院期間眼底鏡檢查未發現視網膜病變，排除其他原因引起的視覺損害、視力下降者。病例組與對照組年齡和性別分布差異無統計學意義(P均＞0.05)。

1.2 DNA的提取與擴增 兩組均于入院次日清晨采集空腹靜脈血5 mL，加EDTA抗凝，-80℃保存。采用血液DNA快速提取法(TKM法，TaKaRa公司)提取全血DNA，紫外分光光度計下測定OD260/OD280大于1.7，且瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA完整性良好。采用PCR法行DNA擴增。AR基因上游引物序列為5'-CCT TTC TGC CAC GCG GGG CGC GGG-3'，下游引物序列為 5'-CAT GGC TGC TGC GCT CCC AG-3'(由TaKaRa公司合成)。PCR反應體系中各組分的終濃度為 DNA樣本0.5 μg，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，dNTPs 0.25 μmol/L，上下游引物各 0.4 μmol/L，滅菌純凈水補足體積至25 μL。擴增條件:95℃預變5 min，95℃1 min，66 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環35次，72 ℃延伸7 min。于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒定電壓90 V，紫外透射反射儀下觀察結果。

1.3 AR基因-106CT多態性檢測 取10 μL PCR產物，加限制性內切酶 BfaⅠ(10 U)1.0 μL，10 ×Buffer K 2.0 μL，雙蒸水(ddH2O)7.0 μL，組成 20 μL的反應體系。置于37℃恒溫水浴箱中反應6 h。酶切反應結束后，取10 μL酶切產物與2 μL上樣緩沖液混合均勻，置于3.5%瓊脂糖凝膠，在恒定電壓90 V、紫外透射反射儀下觀察結果。計算AR基因-106 bp C/T等位基因頻率，等位基因頻率=(2×純合子數+雜合子數)/(2×受檢者例數)。分析AR基因-106 C/T多態性與DR的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗。計數資料用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用單因素Logistic回歸分析對DR發病的危險因素進行分析，計算OR及其95%CI，并對可能的混雜因素進行調整。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AR基因-106 C/T多態性 AR基因PCR擴增產物為263 bp，其中含有一個非特異性BfaⅠ酶切位點，經酶切后產生206、57 bp的兩個片段。AR基因啟動子區域-106 bp C/T為SNP基因多態位點(在206 bp片段中)。當此位點為C時PCR產物不存在BfaⅠ酶切位點，電泳顯示為206 bp的條帶，此為CC型(野生型);為T時產生BfaⅠ酶切位點，206 bp DNA片段被切成147、59 bp的兩條片段，此為TT型(變異型);出現206、147、59 bp三個片段，此為雜合子。見圖1。病例組中，AR基因型頻率CC型為53.42%，CT 型為35.40%，TT 型為11.18%;對照組分別為 39.91%、47.88%、12.21%。病例組 CT/TT基因型頻率低于對照組(χ2=7.104，P=0.029)。病例組等位基因C頻率為71.12%，T為 28.88%;對照組分別為63.85%、36.15%。病例組T等位基因頻率低于對照組 (χ2=4.380，P=0.036)，見表1。

圖1 AR基因PCR限制性酶切產物電泳結果

2.2 AR基因Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗對照組中CC、CT、TT基因型分布頻率與期望頻率差異無統計學意義(P均＞0.05)，符合Hardy-Weinberg定律，說明達到遺傳平衡，具有群體代表性。詳見表2。

表1 病例組與對照組AR基因型和等位基因分布［例(%)］

表2 AR基因型頻率的Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗

2.3 AR基因-106 C/T多態性與DR的關系 單因素Logistic回歸分析結果顯示，-106C/T的CT/TT基因型與 DR 發病有關(OR=0.579，95%CI:0.383～0.876)，且經糖尿病家族史調整后二者間的統計學關聯仍然存在。攜帶T等位基因的2型糖尿病患者發生 DR 的危險性降低(OR=0.717，95%CI:0.525～0.980)。見表3。

表3 AR基因-106C/T多態性與AR的關系

3 討論

AR基因位于人類染色體7q35，全長約18 kb，含有10個外顯子和9個內含子，存在多個多態性位點。已有研究證明，葡萄糖代謝多元醇通路與糖尿病微血管并發癥的發生發展有關［7］。AR作為還原型輔酶Ⅱ依賴型醛酮還原酶家族的單體酶，是多元醇通路中的限速酶，對葡萄糖的親和力較低。在正常血糖濃度下，該酶活性不高，葡萄糖進入細胞后很快被分解，進入三羧酸循環，氧化供能。在高血糖狀態下，AR活性增高將導致大量葡萄糖轉化為山梨醇，由于山梨醇極性很強，難以透過細胞膜，而在細胞內堆積，并引起還原型輔酶Ⅱ、肌醇和Na+-K+-ATP酶活性降低，干擾細胞代謝，破壞組織結構，影響血管通透性，使毛細血管基底膜增厚，導致視網膜微動脈和毛細血管結構改變(如周細胞變性、基底膜增厚和內皮細胞增生等)，最終導致 DR 的發生［8，9］。

近年來，AR基因啟動子-106 C/T多態性與DR的關系逐漸受到學者們的關注。澳大利亞學者［10］率先發現AR基因上游啟動區-106 C/T堿基突變，攜帶C等位基因的糖尿病患者發生DR的危險性增加。有學者［11～15］分別對中國北方漢族、美國、巴西及日本的2型糖尿病患者進行研究，均發現-106C/T的CC基因型與DR的易感性有關。但也有研究［6，16］報道未發現AR基因-106 C/T的多態性與DR的發生有關。本研究結果顯示，攜帶CC基因型和C等位基因的糖尿病患者發生DR的危險性高于CT/TT基因型和T等位基因攜帶者，經DM家族史調整后這種關聯仍然存在，提示AR基因-106C/T的這兩種基因型與DR發病有關。AR基因-106C/T的多態性可能會引起AR表達增加，導致多元醇代謝通路激活，使大量山梨醇在細胞內蓄積，形成細胞內高滲狀態，大量細胞外液滲入，導致細胞水腫。同時，山梨醇改變了細胞膜的通透性，使K+、肌醇等大量丟失，引起組織結構和功能異常，最終導致DR的發生。由于不同研究人群、樣本量不同等原因的影響，本研究結論與相關研究尚存在一定差異，關于AR基因-106 C/T多態性與DR的關聯性，還有待進一步深入研究。

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