妊娠期糖尿病產(chǎn)婦胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)及其對(duì)胎盤組織形態(tài)學(xué)的影響

葉梓瑩，黎 曄，趙 震，曾宇婷，林俊汕

(1增城市人民醫(yī)院，廣東增城511300;2南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀(jì)念醫(yī)院)

妊娠期糖尿病(GDM)的確切發(fā)病機(jī)制尚不明了，可能涉及遺傳、免疫、氧化應(yīng)激、微量元素失調(diào)、胰島素抵抗與受體缺陷、炎癥等多種因素。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能為合成和分泌蛋白質(zhì)、折疊形成蛋白質(zhì)正確的三維空間構(gòu)象、儲(chǔ)存Ca2+、參與脂類物質(zhì)的生物合成。多種因素如高血糖、高血脂、病毒感染、外毒素、促炎細(xì)胞因子及突變蛋白表達(dá)等均會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)，通過激活相應(yīng)信號(hào)通路引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列反應(yīng)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。研究發(fā)現(xiàn)，ERS與糖尿病、胰島素抵抗和肥胖關(guān)系密切［1～3］。GDM與2型糖尿病有部分相同的發(fā)病機(jī)制［4，5］，但 ERS與 GDM 之間的關(guān)系尚不明確。2013年6月，我們觀察了GDM產(chǎn)婦胎盤組織ERS的發(fā)生情況及其對(duì)胎盤組織形態(tài)學(xué)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年7～12月增城市人民醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀(jì)念醫(yī)院收治的產(chǎn)婦60例，均為單胎妊娠，分娩方式均為自然分娩。其中GDM 產(chǎn)婦30 例(GDM 組)，年齡(27.2 ±5.2)歲，孕周(38.2±0.9)周，GDM的診斷參照2011年美國糖尿病學(xué)會(huì)GDM診治標(biāo)準(zhǔn)［6］;健康產(chǎn)婦30例(對(duì)照組)，年齡(27.9 ±4.9)歲，孕周(38.5 ±1.2)周。兩組年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 相關(guān)指標(biāo)觀察 兩組均于胎盤娩出后30 min內(nèi)剪取胎盤中央帶區(qū)全層組織1塊，大小4.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，放入小液氮瓶中，置 -80℃冰箱保存待側(cè)ERS相關(guān)蛋白;另切取適量胎盤組織置4%中性甲醛溶液中待行病理檢查。

1.2.1 胎盤組織ERS相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)胎盤組織中的磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(p-PERK)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)。分別用全蛋白提取試劑盒和BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒提取和測(cè)定蛋白，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，印跡膜在含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液內(nèi)室溫封閉1 h，加入p-PERK和CHOP抗體4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根酶標(biāo)記抗兔IgG，室溫孵育1 h，洗膜后行ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，β-actin為內(nèi)參，顯像圖用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 胎盤組織形態(tài)學(xué)觀察 胎盤組織常規(guī)制成蠟塊，3 μm厚切片，常規(guī)HE染色。觀察胎盤絨毛成熟情況、干絨毛小動(dòng)脈管壁增厚或管腔狹窄情況，合體細(xì)胞結(jié)節(jié)情況，絨毛毛細(xì)血管充盈情況，細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞及血管合體膜形成情況。參考文獻(xiàn)［7，8］對(duì)兩組各項(xiàng)定性、定量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.2.3 胎盤組織形態(tài)學(xué)改變與p-PERK、CHOP表達(dá)的相關(guān)性分析 胎盤組織形態(tài)無病理改變記為-，出現(xiàn)1項(xiàng)病理改變記為+，出現(xiàn)2項(xiàng)病理改變記為++，以此類推。對(duì)兩組不同程度的形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行計(jì)數(shù)，分析其與p-PERK、CHOP表達(dá)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織形態(tài)學(xué)變化 GDM組胎盤絨毛成熟不良輕度15例、重度3例，干絨毛小動(dòng)脈管壁增厚及管腔狹窄輕度21例、重度3例，合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多15例，絨毛間質(zhì)毛細(xì)血管過度充盈輕度12例、重度10例，細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞形成增多9例，血管合體膜形成增多16例;對(duì)照組胎盤絨毛輕度成熟不良4例;干絨毛小動(dòng)脈管壁增厚及管腔狹窄輕度7例、重度4例，合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多6例，絨毛間質(zhì)毛細(xì)血管過度充盈輕度9例、重度1例，細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞形成增多2例，血管合體膜形成增多7例。GDM組胎盤組織各項(xiàng)形態(tài)學(xué)改變例數(shù)均高于對(duì)照組(P均＜0.05)。見圖1、表 1。

圖1 GDM胎盤組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，200×)

表1 兩組胎盤組織形態(tài)學(xué)改變比較［例(%)］

2.2 胎盤組織中p-PERK、CHOP表達(dá) 經(jīng)Image J軟件分析，GDM組p-PERK、CHOP相對(duì)表達(dá)量分別為0.859 ± 0.037、0.975 ± 0.040，分別高于對(duì)照組的0.162 ±0.022、0.273 ±0.021(P 均 ＜0.05)。

2.3 胎盤組織形態(tài)學(xué)改變與p-PERK、CHOP表達(dá)的相關(guān)性分析 雙變量相關(guān)分析顯示 p-PERK、CHOP表達(dá)與胎盤組織形態(tài)病理改變呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.359、0.366，P 均 ＜0.05)。

3 討論

近年來ERS在各型糖尿病發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注。胎盤是胎兒與母體間重要的維系器官，其結(jié)構(gòu)和功能關(guān)乎胎兒的存活。研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者胎盤的細(xì)胞功能、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)均發(fā)生異常改變，造成胎兒體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸與吸收障礙，影響胎兒正常的生長(zhǎng)發(fā)育。GDM患者胎盤雖無特異性的結(jié)構(gòu)改變，但很多形態(tài)變化程度、涉及的病變范圍均與正常胎盤有明顯差異。40%～50%的GDM胎盤絨毛形態(tài)與妊娠周數(shù)相符，50%～60%的胎盤存在絨毛發(fā)育完全或部分不成熟［9］。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)GDM產(chǎn)婦的胎盤組織存在絨毛成熟不良，合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多，干絨毛小動(dòng)脈管壁增厚及管腔狹窄，絨毛間質(zhì)毛細(xì)血管出現(xiàn)過度充盈等異常改變［7，10］，還可出現(xiàn)合體滋養(yǎng)層異常、細(xì)胞滋養(yǎng)層增生、滋養(yǎng)層基底膜增厚以及小血管管腔變狹窄等［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，GDM產(chǎn)婦的胎盤組織存在多項(xiàng)病理改變，表現(xiàn)為絨毛成熟不良、干絨毛小動(dòng)脈管壁增厚及管腔狹窄、合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多、絨毛間質(zhì)中毛細(xì)血管過度充盈、細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞及血管合體膜形成增加，均高于對(duì)照組，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。目前GDM胎盤組織發(fā)生病理改變的確切機(jī)制尚未完全闡明，普遍認(rèn)為可能與慢性缺氧及高糖環(huán)境刺激導(dǎo)致微血管及內(nèi)環(huán)境的變化有關(guān)［12，13］。

ERS是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，程度過強(qiáng)或長(zhǎng)時(shí)間處于ERS狀態(tài)會(huì)引發(fā)細(xì)胞一系列病理變化甚至引起疾病。ERS下主要有三種跨膜蛋白介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，PERK是其中較為重要的一種。ERS發(fā)生后，PEKR發(fā)生自身磷酸化變?yōu)閜-PERK而激活，其激活后會(huì)使eIF2α磷酸化，抑制蛋白質(zhì)翻譯的起始，緩解ERS，有利于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［14］。但PERK蛋白緩解ERS的作用只出現(xiàn)在其短暫活化狀態(tài)時(shí)，而持久的活化則會(huì)加速胰島素降解、細(xì)胞凋亡而損傷胰島B細(xì)胞功能，引發(fā)糖尿?。?5］。CHOP是一種ERS特異性蛋白，當(dāng)ERS持續(xù)存在或反應(yīng)過強(qiáng)時(shí)，CHOP被誘導(dǎo)表達(dá)增多，繼而啟動(dòng)ERS相關(guān)凋亡程序，引起胰島 B細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致糖尿?。?6］，CHOP基因敲除后則可增強(qiáng)胰島B細(xì)胞對(duì)抗ERS所導(dǎo)致的凋亡，從而遏制糖尿病的發(fā)展［17］。

本研究結(jié)果顯示，GDM組胎盤組織中p-PERK、CHOP蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，表明GDM產(chǎn)婦胎盤組織存在ERS。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p-PERK、CHOP表達(dá)與胎盤組織形態(tài)學(xué)病理改變呈正相關(guān)關(guān)系，提示ERS與GDM的發(fā)病有關(guān)，一定程度上參與了GDM胎盤組織的異常形態(tài)學(xué)改變。但ERS在GDM發(fā)病中的確切機(jī)制尚不能完全闡明，仍有待于進(jìn)一步研究。

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