56例疑診顱內感染患者腦脊液中病原菌的基因芯片技術檢測結果

丁錦榮，管義祥，吳德模，張春秀

(1南通大學附屬海安醫院，江蘇南通226600;2生物芯片上海國家工程研究中心研發部)

目前，顱內細菌感染的診斷主要依靠腦脊液細菌培養，但細菌培養周期長，且細菌極易受環境影響，出現標本污染、細菌壞死等可能。單純依靠腦脊液細菌培養進行致病菌的鑒定明顯滯后于臨床治療［1］。基因芯片技術是20世紀90年代發展起來的一項新型生物技術，具有快速、高效、敏感度及準確性高、操作簡單等優點，能同時對常見致病菌特異性的DNA 進行檢測［2，3］。2010年1月～2013年6月，我們選擇顱內感染常見致病菌的DNA特異序列設計并制作復合基因芯片，用于56例疑診顱內感染患者腦脊液中病原菌的檢測。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 疑診顱內感染患者56例，男40例，女16例;年齡23～72(46.8±12.8)歲。顱內感染的臨床診斷參照Harrison標準［4］及神經外科特點［5］，其中腦脊液鼻漏患者2例，開放性腦外傷患者8例，手術時間超過4 h者26例，2次手術患者18例，腦出血腦室引流術后患者2例。臨床表現為高熱48例，腦膜刺激征32例，顱內高壓18例，所有病例腦脊液常規檢查均提示WBC＞1.18×109/L。

1.2 主要儀器及試劑 PMC-082芯片離心機，OmniGridTM100微陣列點樣器，分子雜交箱，GenPix 400B共聚焦激光掃描儀，GenPix Pro 6.0圖像掃描和分析軟件，DNeasy Blood＆Tissue Kit，光學級醛基化修飾芯片。

1.3 腦脊液標本采集 嚴格無菌操作下腰穿留取腦脊液標本，其中送腦脊液培養留取5～8 mL，送基因芯片檢測腦脊液標本約2 mL。為避免標本污染及細菌凋亡或壞死，所送腦脊液標本要求在1 h內送檢。

1.4 腦脊液細菌培養 應用接種環挑取腦脊液樣本并接種于血瓊脂平板及巧克力瓊脂平板上，于35℃、5%CO2培養箱中培養24～48 h后涂片檢查，觀察菌群形態，鑒定細菌種類。

1.5 基因芯片技術應用方法 取約2 mL腦脊液標本在離心機中以8 000 r/min離心10 min，棄上清;加等量滅菌生理鹽水充分震蕩，懸浮沉淀后再次以8 000 r/min離心10 min，棄上清;加入DNA裂解液180 μL，充分震蕩混勻，于37℃溫浴30 min;加入25 μL 蛋白酶 K，56 ℃ 下溫浴 30 min;加入 200 μL乙醇，采用離心柱提取腦脊液細菌DNA。在Genbank數據庫中篩選出4種顱內感染常見細菌［金黃色葡萄球菌(SA)、肺炎克雷伯菌(KNP)、大腸桿菌(E.coli)、肺炎雙球菌(PC)］的特異DNA序列及靶序列。用 Primer Premier 5.0軟件設計出菌株的PCR引物，同時選擇所有細菌共有的16S基因設計引物和探針作為陽性對照。將提取的DNA用聚合酶鏈反應技術擴增，在反應底物中加入一定濃度的Cy3-dUTP熒光標志物，使其混入聚合酶鏈反應擴增產物中，作為雜交后激光掃描儀掃描檢測的標記。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳及結果判定(2%瓊脂糖，150 V，電泳時間15 min)。結果可見相應的清晰條帶(圖1)，設計的引物序列特異、有效。進行基片的活化處理，將合成的Oligo(探針)用點樣液稀釋至濃度50 mmol/L，并放入 384孔板中，每孔 10 μL。用點樣儀點樣探針于活化的基片上，點樣矩陣為6×6，各點隨機排列，每個探針位點重復4次(表1)。點樣后將芯片固定、洗凈，并離心甩干，置于干燥箱中保存備用。在48℃下將備用的Cy3熒光標記聚合酶鏈反應產物與雜交液按1∶2比例離心機下混勻后的混合液進行熱變性2 h，冰浴驟冷后，加樣于芯片上的點樣區。封片后在42℃下水浴雜交2～3 h，雜交結束后清洗甩干，應用GenPix 400B共聚焦激光掃描儀進行掃描(波長532 nm)。用GenPix Pro 6.0圖像掃描和分析軟件提取每個探針位點的熒光信號強度值，去除低信號位點，高于cut off值(SNR=3.0)的探針信號為有效信號。

圖1 常見顱內感染細菌基因檢測的PCR產物電泳圖

表1 細菌基因檢測芯片排布圖

2 結果

聚合酶鏈反應產物與特異性探針雜交后，在基因芯片上相應的位點顯示出綠色熒光，從而鑒定出相應的細菌種類(圖2)。

圖2 基因芯片鑒定菌種

56例實驗標本中，經腦脊液細菌培養確診顱內感染18例，診斷陽性率為32.14%，病原菌為金黃色葡萄糖球菌6例，肺炎克雷伯菌3例，大腸桿菌2例，肺炎雙球菌2例，鮑曼不動桿菌2例，銅綠假單胞菌2例，耳葡萄糖球菌1例;基因芯片技術確診顱內感染38例，診斷陽性率為39.29%，明確顱內感染致病菌22例，其中金黃色葡萄糖球菌8例，肺炎克雷伯菌5例，大腸桿菌5例，肺炎雙球菌4例，與腦脊液細菌培養陽性標本結果完全符合;16例未能鑒定出致病菌，但檢出16S基因。

3 討論

腦脊液細菌培養以其高特異性作為顱內感染的診斷金標準。但腦脊液細菌培養所需時間長(常需2～3個工作日，如果為霉菌、結核桿菌，則時間更長［6］)，且容易受到各種因素干擾，存在諸多不足，比如肺炎雙球菌，雖是顱內細菌感染常見菌，但因其對營養的要求高，送檢過程中容易出現細菌壞死或凋亡，以致培養陽性率很低。

基因芯片技術操作簡單，檢測迅捷，其所用聚合酶鏈反應技術對標本中細菌要求低，即使菌落數很少，細菌已壞死或凋亡，只要標本中含有微量的目的DNA，甚至于只要存在部分降解的DNA序列，也可通過聚合酶鏈反應技術實施樣本的擴增，從而檢測出相應的致病菌［7，8］。基因芯片技術發展有以下趨勢:①基因芯片的高密度化，將更多致病菌的特異DNA序列加入基因芯片中，使得探針的效率提高，同一張基因芯片可以更高效的同時探測更多種類的致病菌;②基因芯片的商品化［9］，隨著臨床需求的增多，更多的基因芯片生產廠家加入到顱內感染致病菌基因芯片的制備中，將會有更多商品化的顱內感染細菌基因檢測試劑盒問世，在基因芯片小型化，所需樣本微量化上一定會取得長足的進展，將會大大降低目前基因檢測的成本，提高檢測的靈敏度，促進基因芯片技術在臨床快速診斷顱內細菌感染中的應用。

本研究中38例經基因芯片技術確診顱內感染病例中有16例未能鑒定出致病菌，但仍檢出16S基因，其原因在于我們所制備的聚合酶鏈反應底物不包括這些致病菌的特異性DNA序列，但這些細菌仍保留著16S rDNA基因。有20例腦脊液標本未能培養出致病菌，而基因芯片技術鑒定出菌種，而這些病例均有著明顯的顱內感染征象，考慮以下可能:①顱內感染早期，腦脊液中細菌含量低，而目前細菌培養所用的乳膠凝集實驗對最低菌落數有最低要求［10］，要提高陽性率就需要更多的檢測樣本;②目前臨床早期經驗型抗生素的治療一定程度上降低了腦脊液培養的陽性率。另有18例臨床診斷為顱內感染，但未能通過基因芯片技術證實致病菌的存在。可能原因:①部分樣本的DNA含量過低，雖經多次擴增，仍未獲得熒光標記所需要的最少DNA量;②實驗所用熒光標記法自身存在敏感度不高的缺陷;③臨床存在一定量的假性腦膜炎病例，雖有顱內感染表現，但無感染病原菌的存在。

本研究選取4種常見顱內感染致病菌的特異DNA序列制作復合基因芯片，通過基因芯片技術，1 d內完成了對可疑腦脊液標本的檢測，檢測結果與腦脊液細菌培養一致，而且檢測出腦脊液培養陰性的顱內細菌感染［11］。可見，基因芯片技術對顱內感染的診斷陽性率及金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌的檢出率高于細菌培養，值得借鑒。

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