宮頸病變組織中Vimentin、P16INK4A、Smad4的定位、表達(dá)及其在EMT中的作用

韓淑珍，熊 暉，王小英，陳小毅，王 森

(1廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院，廣東東莞523900;2廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;3廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在導(dǎo)致婦女死亡的惡性腫瘤中占第二位，人乳頭瘤病毒(HPV)感染是子宮頸癌的首要病因。P16INK4A/Rb是HPV致癌作用的兩大重要途徑之一，P16INK4A基因在大部分惡性腫瘤中表達(dá)缺失，但在宮頸癌中表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)，在宮頸癌中的具體作用尚不明確。P16INK4A高表達(dá)對(duì)宮頸癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有何影響目前尚無(wú)研究報(bào)道。我們觀察了Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸癌及前期病變中的定位與表達(dá)水平，探討其對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT的影響和可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年2月～2013年4月廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診宮頸活檢病例共120例，其中慢性子宮頸炎、低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、高級(jí)別CIN和宮頸癌各30例。患者年齡16～78歲，中位年齡36歲。標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)切片，分別做HE和免疫組織化學(xué)染色。CIN和宮頸癌病例術(shù)前均未接受放化療和其他針對(duì)腫瘤的治療，所有病例在厚街醫(yī)院病理科確認(rèn)并復(fù)審。

1.2 主要試劑 APES購(gòu)于福州邁新有限公司，PV-6000免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、小鼠抗人單克隆抗體Vimentin(克隆號(hào)V9，批號(hào)18J1779A)和P16INK4A(克隆號(hào)G175-405)購(gòu)于DAKO公司，小鼠抗人單克隆抗體Smad4(sc-7966)購(gòu)自Santa Cruz有限公司。

1.3 Vimentin、P16INK4A和Smad4檢測(cè)方法 免疫組織化學(xué)染色按照PV-6000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，Smad4抗體工作濃度為1∶200，其余抗體為工作液。實(shí)驗(yàn)中以已知陽(yáng)性組織為陽(yáng)性對(duì)照、PBS代替一抗作為空白對(duì)照。由兩人分別獨(dú)立對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估。光鏡觀察Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的表達(dá)定位。400×光鏡下計(jì)數(shù)至少400個(gè)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果判斷:①按陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分:無(wú)陽(yáng)性表達(dá)腫瘤細(xì)胞計(jì)0分;陽(yáng)性細(xì)胞≤25%計(jì)1分;26%～50%計(jì)2分;≥51%計(jì)3分。②按染色強(qiáng)弱計(jì)分:無(wú)染色計(jì)0分;淡黃色計(jì)1分;黃色計(jì)2分;棕黃色計(jì)3分。兩項(xiàng)相乘，評(píng)分0分為陰性，1～4分為陽(yáng)性，6～9分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vimentin、P16INK4A和 Smad4在宮頸病變組織中的定位 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宮頸病變組織中呈不同程度陽(yáng)性表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均可表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的表達(dá)(×200)

2.2 Vimentin、P16INK4A和 Smad4在宮頸病變組織中的表達(dá)水平 見(jiàn)表1。

表1 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(%)

2.3 宮頸病變組織中 Vimentin、P16INK4A和 Smad4表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Vimentin在慢性子宮頸炎、低級(jí)別CIN、高級(jí)別CIN和宮頸癌組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。P16INK4A在慢性子宮頸炎組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)為陰性，在低級(jí)別CIN、高級(jí)別CIN和宮頸癌組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)水平均增加(P均＜0.01)。Smad4在慢性子宮頸炎組織中細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均為高表達(dá)，細(xì)胞核中Smad4在低級(jí)別CIN、高級(jí)別CIN和宮頸癌組織中表達(dá)水平降低(P均＜0.01);Smad4在4者細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Spearman相關(guān)分析顯示，120例宮頸病變組織中Smad4核表達(dá)與P16INK4A的核質(zhì)表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為 -0.274、-0.387，P 均 ＜0.01)，Smad4核表達(dá)與Vimentin核表達(dá)亦呈負(fù)相關(guān)(r=-0.209，P＜0.05)，P16INK4A核質(zhì)表達(dá)與Vimentin核表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.334、0.443，P 均 ＜0.01)。宮頸癌組織中Vimentin、P16INK4A和Smad4無(wú)論細(xì)胞核表達(dá)或細(xì)胞質(zhì)表達(dá)均與宮頸癌的分化和年齡無(wú)相關(guān)關(guān)系(P均＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Vimentin、P16INK4A和Smad4在宮頸病變組織中的表達(dá)定位與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(%)

3 討論

EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有研究［1］表明宮頸癌中存在著EMT，E-cadherin表達(dá)減少和Vimentin表達(dá)增高是宮頸癌浸潤(rùn)進(jìn)展的重要指標(biāo)［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著宮頸病變程度的增加，Vimentin表達(dá)水平不斷增加;宮頸癌、高級(jí)別CIN組織Vimentin表達(dá)水平高于低級(jí)別CIN與慢性子宮頸炎組織，與其他學(xué)者的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中Vimentin在細(xì)胞核中表達(dá)高于細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)，Spearman相關(guān)分析顯示Vimentin核表達(dá)與病變組織學(xué)類(lèi)型相關(guān)，提示Vimentin核表達(dá)在宮頸癌的浸潤(rùn)進(jìn)展中起主要作用，這一結(jié)果與我們?cè)诒茄拾〦MT 中的研究［3］相似。

P16INK4A是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(CDK)抑制因子，在大部分惡性腫瘤中表達(dá)缺失，但在宮頸癌中P16INK4A表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)。有學(xué)者［4］認(rèn)為P16INK4A在宮頸癌中高表達(dá)僅僅是HPV抑制Rb負(fù)反饋調(diào)節(jié)P16INK4A的結(jié)果。目前國(guó)內(nèi)外無(wú)P16INK4A高表達(dá)對(duì)宮頸癌直接影響及機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道。最近，Burd等［5］用螢光素酶基因敲入小鼠模型P16(LUC)觀察發(fā)現(xiàn)，在腫瘤形成和間質(zhì)細(xì)胞圍繞時(shí)P16INK4A的激活非常明顯，提示P16INK4A的激活是腫瘤形成的一種特征。已有文獻(xiàn)［6～10］報(bào)道，在某些腫瘤中，P16INK4A作為β-catenin、RhoC等的靶基因參與EMT的調(diào)控，P16INK4A過(guò)表達(dá)與Twist1啟動(dòng)子過(guò)甲基化存在相關(guān)性，這些研究結(jié)果都間接提示P16INK4A在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，P16INK4A高表達(dá)的其中一個(gè)原因可能是P16 exon1在宮頸癌組織中擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)較癌旁正常組織明顯增加而引起［11］。本實(shí)驗(yàn)中免疫組化結(jié)果顯示，P16INK4A不僅在CIN及宮頸癌組織的細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)，在細(xì)胞核中亦高表達(dá)，且P16INK4A與Vimentin核表達(dá)呈正相關(guān)，P16INK4A在CIN和宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于慢性子宮頸炎組織，提示P16INK4A參與宮頸癌EMT并發(fā)揮重要作用。

Smad4是腫瘤抑制基因DPC4的產(chǎn)物，在多種腫瘤中都有表達(dá)。TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤中具有重要地位，但Smad在宮頸癌進(jìn)展中的具體定位和作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，Smad4蛋白在慢性子宮頸炎組織中細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均為高表達(dá)，Smad4細(xì)胞質(zhì)表達(dá)水平在不同宮頸病變中無(wú)明顯差異，細(xì)胞核中Smad4在低級(jí)別CIN、高級(jí)別CIN和宮頸癌組織中表達(dá)逐漸降低，表達(dá)定位結(jié)果與張琰等［12］報(bào)道相似。本實(shí)驗(yàn)中Smad4核表達(dá)與Vimentin核表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示進(jìn)入細(xì)胞核的Smad4表達(dá)下降可能是引起宮頸癌細(xì)胞EMT的原因之一，與薜慧婷等［13］報(bào)道低表達(dá) Smad4可抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞EMT的結(jié)果相反。Smad4核表達(dá)降低使TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制反應(yīng)性減弱，可能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化［14～16］，宮頸癌患者無(wú)病生存期縮短及5年總生存率下降［17］。國(guó)外研究報(bào)道［18］抑制Cdk4/6可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT，并增加胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，是通過(guò)Smad依賴(lài)的TGF-β途徑進(jìn)行。我們前期研究［19］通過(guò)免疫共沉淀和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中過(guò)度表達(dá)的P16INK4A仍然具有結(jié)合Cdk4的能力。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)Spearman相關(guān)分析結(jié)果，120例宮頸病變組織中Smad4核表達(dá)與P16INK4A核質(zhì)表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，提示P16INK4A可能通過(guò)結(jié)合Cdk4并抑制其活性，協(xié)同或影響Smad4核表達(dá)參與宮頸癌發(fā)生EMT，其效應(yīng)途徑有待進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)研究證實(shí)。

綜上所述，Vimentin核表達(dá)增強(qiáng)是診斷宮頸癌細(xì)胞EMT的有效指標(biāo)。P16INK4A高表達(dá)和Smad4核表達(dá)下降參與了宮頸癌細(xì)胞 EMT。進(jìn)一步研究P16INK4A高表達(dá)在宮頸癌中調(diào)控的分子機(jī)制，有利于探討宮頸癌細(xì)胞EMT的形成，為宮頸癌治療性疫苗的新靶點(diǎn)研制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Koay MH，Crook M，Stewart CJ.Cyclin D1，E-cadherin and betacatenin expression in FIGO Stage IA cervical squamous carcinoma:diagnostic value and evidence for epithelial-mesenchymal transition［J］.Histopathology，2012，61(6):1125-1133.

［2］Myong NH.Loss of E-cadherin and acquisition of Vimentin in epithelial-mesenchymal transition are noble indicators of uterine cervix cancer progression ［J］.Korean J Pathol，2012，46(4):341-348.

［3］Luo W，F(xiàn)ang W，Li S，et al.Aberrant expression of nuclear vimentin and related epithelial-mesenchymal transition markers in nasopharyngeal carcinoma［J］.Int J Cancer，2012，131(8):1863-1873.

［4］Kanao H，Enomoto T，Ueda Y，et al.Correlation between p14(ARF)/p16(INK4A)expression and HPV infection in uterine cervical cancer［J］.Cancer Lett，2004，213(1):31-37.

［5］Burd CE，Sorrentino JA，Clark KS，et al.Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model［J］.Cell，2013，152(1-2):340-351.

［6］Delmas V，Beermann F，Martinozzi S，et al.Beta-catenin induces immortalization of melanocytes by suppressing p16INK4aexpression and cooperates with N-Ras in melanoma development［J］.Genes Dev，2007，21(22):2923-2935.

［7］ Wang Z，Banerjee S，Ahmad A，et al.Activated K-ras and INK4a/Arf deficiency cooperate during the development of pancreatic cancer by activation of Notch and NF-κB signaling pathways［J］.PLoS One，2011，6(6):e20537.

［8］Xie S，Zhu M，Lv G，et al.The role of RhoC in the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells［J］.Med Oncol，2012，29(3):1802-1809.

［9］ Fischer AN，F(xiàn)uchs E，Mikula M，et al.PDGF essentially links TGF-beta signaling to nuclear beta-catenin accumulation in hepatocellular carcinoma progression ［J］.Oncogene，2007，26(23):3395-3405.

［10］Missaoui N，Hmissa S，Trabelsi A，et al.Promoter hypermethylation of CDH13，DAPK1 and TWIST1 genes in precancerous and cancerous lesions of the uterine cervix ［J］.Pathol Res Pract，2011，207(1):37-42.

［11］鄭曉娟，胡新榮，唐澤立，等.p16與eIF4E在宮頸癌中基因改變情況的初步研究［J］.實(shí)用癌癥雜志，2011，26(1):13-15.

［12］張琰，曹旭，江明，等.Smad4在白血病細(xì)胞中表達(dá)的初步研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006，14(4):210-212.

［13］薜慧婷，王宏剛，黃曉丹，等.低表達(dá)Smad4對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［J］.世界華人消化雜志，2012，20(11):923-929.

［14］張競(jìng)，李勝澤.TGF-β1及Smad4蛋白在子宮頸癌組織中的表達(dá)及其意義［J］.實(shí)用癌癥雜志，2008，23(5):465-468.

［15］Zhang B，Halder SK，Kashikar ND，et al.Antimetastatic role of Smad4 signaling in colorectal cancer［J］.Gastroenterology，2010，138(3):969-980.

［16］李巧稚，阿提開(kāi)姆·阿布都克熱木，王燕，等.子宮頸癌中Smad4和Runx3表達(dá)與HPV16感染的關(guān)系［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28(10):1112-1115.

［17］Kloth JN，Kenter GG，Spijker HS，et al.Expression of Smad2 and Smad4 in cervical cancer:absent nuclear Smad4 expression correlates with poor survival［J］.Mod Pathol，2008，21(7):866-875.

［18］Liu F，Korc M.Cdk4/6 inhibition induces epithelial-mesenchymal transition and enhances invasiveness in pancreatic cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2012，11(10):2138-2148.

［19］龐天云，鄧飛，鄭曉娟，等.抑癌基因蛋白p16在宮頸癌中過(guò)度表達(dá)對(duì)其結(jié)合Cdk4功能的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32(1):50-53.