高效液相色譜法測定血清卡馬西平的優(yōu)化方案

肖潤梅，郭珍立，孫敬智，陳 勇

(1湖北大學(xué)生命科學(xué)院湖北省生物技術(shù)省重點實驗室，武漢430062;2湖北省新華醫(yī)院)

卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)作為亞氨基二苯乙烯衍生物，是目前兒科臨床最常用的抗癲癇藥(Antiepileptic drugs，AEDs)之一，更是治療單純及復(fù)雜部分性發(fā)作的首選藥物［2］。由于其血藥濃度范圍窄，且存在明顯的個體差異，易發(fā)生不良反應(yīng)［3］。為了提高臨床用藥的有效性和安全性，減少不良反應(yīng)，需要對治療藥物卡馬西平進(jìn)行監(jiān)測。用高效液相色譜法測定血清抗癲癇類藥物的方法學(xué)研究已被廣泛報道［4］，但對實驗方法中樣品前處理各種因素的選擇較少報道。2013年2～5月，我們探討建立以高效液相色譜法測定人血清CBZ濃度的實驗方法優(yōu)化方案。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 Waters 2695-2998高效液相色譜儀(配光電二極管陣列檢測器，美國Waters公司)，KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DK-450B型電熱恒溫水槽(上海深信實驗儀器有限公司)，HP-01系列溶劑過濾器、OHAUS萬分之一電子天平(德國Sartorious公司)，TDL80-2B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，XK96-B快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)。本實驗中所用試劑除另有說明外均為分析純試劑，水為去離子水。甲醇(色譜純 J.T.Baker)，CBZ對照品(批號:100142-201105)，苯巴比妥對照品(批號:171222-200605)，苯妥英鈉對照品(批號:100210-201002)均購于中國藥品生物制品檢定所。乙酸乙酯(批號:T20110629)，乙醚(批號:20110412)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的建立 色譜柱:Hypersil C18(200 mm ×4.6 mm，10 μm);采用梯度洗脫方式;二極管陣列檢測波長;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.2 血清預(yù)處理方法 采集患者血液后37℃水浴30 min，2 000 r/min速度離心4 min，放置4℃冰箱冷藏待用［5］。

1.2.3 樣品預(yù)處理優(yōu)化選擇 ①萃取溶劑的選擇:考察了乙醚、乙酸乙酯2種萃取劑對 CBZ的影響［6］，取0.2 mL 上清液分別與乙醚、乙酸乙酯各600 μL混合渦旋2 min，以3 500 r/min速度離心4 min，水浴中揮發(fā)至干，用1.0 mL流動相溶解殘留物，10 000 r/min離心20 min后進(jìn)樣分析［7］。②樣品與萃取劑比例的選擇:取0.2 mL樣品上清液分別與0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 乙酸乙酯混合提取，考察不同體積比的樣品與萃取劑對萃取效率的影響。③萃取時間的選擇:將樣品與萃取劑混合后渦旋萃取，萃取時間選擇 3、6、9、12 min，考察不同萃取時間對萃取效率的影響。

1.2.4 工作曲線的繪制 CBZ標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取CBZ對照品，用甲醇定容。配制成CBZ(2.468、4.937、7.406、9.875、12.344、24.688 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)液系列［8］，按樣品處理方法進(jìn)行處理后，以外標(biāo)法進(jìn)行定量測定［9］。

1.2.5 檢出限計算方法 將高效液相色譜儀調(diào)節(jié)至最佳測定狀態(tài)，按研制的測定方法連續(xù)7次測定接近空白濃度的溶液，由測定值計算濃度平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度為檢出限［10］。

1.2.6 準(zhǔn)確度和精密度計算方法 將血清樣品分成4組，一組為空白組值，其余三組經(jīng)樣品處理后分別加入高、中、低3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組6個樣品。測定后取平均值，減去空白組值，計算準(zhǔn)確度和精密度［11］。

2 結(jié)果

2.1 流動相及洗脫程序 CBZ在梯度洗脫中流動相比例甲醇∶水 =61.3∶38.7，7.9 min 時出峰，其標(biāo)準(zhǔn)和樣品色譜圖見圖1、2。

圖1 CBZ標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 CBZ樣品色譜圖

2.2 樣品預(yù)處理的優(yōu)化條件

2.2.1 萃取溶劑 乙酸乙酯提取樣品中CBZ的濃度為7.071 μg/mL，乙醚提取樣品中CBZ的濃度為9.674 μg/mL。

2.2.2 樣品與萃取劑體積比 不同體積比的樣品與萃取劑對萃取效率的影響見圖3。

圖3 樣品與萃取劑比例的選擇

2.2.3 萃取時間 萃取3、6、9、12 min時測得藥物濃度分別為 24.0、22.2、25.0、19.1 μg/mL。結(jié)果表明血清藥物濃度隨萃取時間的增加變化不大，萃取時間選擇為3 min。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 測定組分CBZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。線性方程為 Y=3.79e+0.03X-8.80e+0.03，線性范圍為1.52～48.8 mg/L，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，可滿足測定需要。

2.2.5 檢出限 測得血清中CBZ的最低檢出濃度為0.4 mg/L。

2.2.6 準(zhǔn)確度和精密度 血清中CBZ的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見表1。

圖4 CBZ標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 血清中CBZ的準(zhǔn)確度和精密度

3 討論

流動相及洗脫程序的確定中CBZ的出峰時間在甲醇濃度為50%以后，保留時間較集中。由于梯度洗脫平衡柱子需要的時間長［12］，且實驗室考慮與做其他藥物血藥濃度測定的流動相比較相似，為了簡化液相流動相平衡的時間和實驗室便于記憶，所以將卡馬西平的流動相確定為甲醇∶水=60∶40的等度洗脫方式。二極管陣列檢測波長在210～400 nm，檢測波長為254 nm。

萃取溶劑的選擇中乙酸乙酯提取率/乙醚提取率為73.09%。實驗選擇乙酸乙酯做萃取劑主要基于以下幾點原因:①乙醚的低沸點易揮發(fā)特性使得用乙醚萃取的時候很難定量，實驗使用乙醚時為了定量必須萃取4次才能把血清中的藥物提取干凈。而用乙酸乙酯做萃取劑時容易定量，只需要提取1次，簡化了實驗。②水浴揮發(fā)乙酸乙酯將水浴溫度提高到75℃時，得到的產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對，其保留時間沒有改變，同時也沒有新物質(zhì)生成。將水浴溫度56℃與75℃揮發(fā)所得產(chǎn)物濃度比較，沒有顯著性差別。說明提高水浴溫度對藥物性質(zhì)和濃度沒有影響，克服了乙酸乙酯沸點高、揮發(fā)時間長的缺點。③乙酸乙酯對CBZ的提取率雖然比乙醚低，但是乙酸乙酯的的提取率/乙醚的提取率也達(dá)到73.09%，可以滿足臨床血藥濃度檢測的需要，因此實驗選擇乙酸乙酯做萃取劑。

萃取溶劑用量過少時，目標(biāo)組分不能被充分萃入有機(jī)相，而溶劑用量過多時，則會導(dǎo)致樣品被稀釋，并延長揮發(fā)萃取液的時間［13］?？疾炝瞬煌w積比的樣品(200 μL)與萃取劑對萃取效率的影響。綜合考慮組分的低、高濃度的萃取效率，選擇樣品與萃取劑的體積比為1∶3。高濃度的萃取濃度明顯隨著溶劑的增加增大，但是當(dāng)樣品與萃取劑體積比例為1∶5時萃取濃度反而降低，分析是由于實驗使用1.5 mL的 EP 管，受到體積的限制，樣品(200 μL)與萃取劑比例為1∶5時(總體積為1.2 mL)的渦旋提取率明顯降低。

本文成功建立了以高效液相色譜法測定人血清CBZ濃度的優(yōu)化方案，確定了最佳樣品預(yù)處理條件，優(yōu)化了色譜分離及檢測條件，提高了檢測靈敏度。所建立的高效液相色譜法具有靈敏、準(zhǔn)確、快速等特點，能夠滿足臨床治療中藥物濃度監(jiān)測工作的要求。

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