HPLC法研究唑尼沙胺分散片在中國健康志愿者的藥動學

戴 青，陳勇川，邱學文，向榮鳳，熊麗蓉（第三軍醫大學西南醫院藥劑科，國家藥品臨床研究基地，重慶 400038）

唑尼沙胺（zonisamide，ZNS），化學名為1，2-苯并異 唑-3-甲磺酰胺[1-2]，是新型廣譜抗癲癇藥物，1989年在日本首次獲準上市。臨床上常用于癲癇大發作、小發作、局限性發作、癲癇持續狀態及精神運動性發作等治療[3]。

國內曾有HPLC法[4-6]檢測唑尼沙胺血藥濃度的報道，其分析過程復雜，以磷酸鹽緩沖液[4，6]作為流動相，由于磷酸鹽不易清洗，對色譜柱及液相色譜系統均易造成損害。本實驗改用乙腈-0.1%三氟乙酸作為流動相，其配制過程簡單且易沖洗。在血樣的處理上，文獻[6]采用液液萃取的方法，實際操作繁瑣且耗時，本文選用6%高氯酸沉淀蛋白，所需體積少（只需與血樣等體積即可），沉淀蛋白效果明顯，無干擾，分析時間短。本實驗快捷、簡便、靈敏度高，通過對唑尼沙胺藥動學的研究，以期為臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2690 Alliance液相色譜儀（含Waters 2487紫外檢測器，Millennium32數據采集處理軟件，美國Waters公司）；高速離心機（美國Abbott公司）；Milli-Q plus超純水器（美國Millipore公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex Genius 3圓周振蕩器（德國IKA公司）。

唑尼沙胺分散片（蘇州工業園區天龍制藥有限公司，規格：100 mg，批號081125）；唑尼沙胺標準品（蘇州工業園區天龍制藥有限公司，含量：99.8%，批號080601）；羥苯甲酯標準品（蘇州工業園區天龍制藥有限公司，批號090915）；乙腈為色譜純（美國迪馬公司）；高氯酸為分析純（成都天華科技股份有限公司）；三氟乙酸為分析純（天津市光復精細化工研究所）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.1%三氟乙酸（33∶67）；流速：1.6 mL·min-1；檢測波長：284 nm；進樣量：20 μL。

2.2 受試者選擇

共入選30名健康志愿者，經常規體檢、心電圖及生化檢驗結果均正常，精神狀態良好。受試前2周及實驗期間未服用其他藥物，實驗期間忌煙、酒和油膩食物，統一飲食，受試者對實驗目的和要求完全知情，實驗前志愿簽署知情同意書，并經本院倫理委員會的批準。單次給藥女性受試者15例，年齡（26.47 ± 6.47）歲，身高（156.87 ± 4.29） cm，體質量（52.47 ± 5.29） kg；單次給藥男性受試者15例，年齡（21.60 ± 0.91）歲，身高（171.67 ± 5.81） cm，體質量（61.87 ± 5.52） kg。多次給藥女性受試者5例，年齡（22.40 ± 0.55）歲，身高（159.20 ± 3.70） cm，體質量（52.10 ± 2.25） kg；多次給藥男性受試者5例，年齡（23.00 ± 1.00）歲，身高（173.20 ± 5.45） cm，體質量（68.00 ± 4.36） kg。其中，多次給藥組一名受試者在實驗服藥階段自動退出，多次給藥組實際完成9例。

2.3 實驗方案

單次給藥：30名受試者（15名男性，15名女性）隨機分配至3個劑量組（200、300、400 mg），每組10人。每位受試者早晨空腹用200 mL溫水口服設定劑量的唑尼沙胺分散片，給藥后2 h方可飲水，4 h后進統一標準餐。分別于給藥前和開始給藥后1、2、3、4、5、6、8、12、24、48、72、120、180、240和300 h取靜脈血4.0 mL，肝素抗凝，離心5 min（4000 r·min-1），分離血漿，– 65 ℃冷凍保存至測定。

多次給藥：文獻[7]報道唑尼沙胺達到穩態需要13～ 14 d，10名參加300 mg單次劑量組的受試者于單劑量實驗結束后第3天進入多劑量研究，每天一次服用唑尼沙胺分散片300 mg，連續服用14 d。在第12、13、14次給藥前和第14次給藥后1、2、3、4、5、6、8、12、24、48、72、120、180、240和300 h取靜脈血4.0 mL，肝素抗凝，離心5 min（4000 r·min-1），分離血漿，– 65 ℃冷凍保存至測定。

2.4 標準溶液的制備

精密稱取唑尼沙胺標準品10.02 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，備用。

精密稱取羥苯甲酯（內標）標準品10.00 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻；再從中取2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻，備用。

2.5 血漿樣品處理

取待測血漿0.25 mL，加入10 μL內標乙腈液（0.2 mg·mL-1），混勻30 s，再加入6%高氯酸0.25 mL，振蕩混勻2 min，離心5 min（13 000 r·min-1），取上清液20 μL進樣。

2.6 專屬性考察

由圖1可見，在本實驗條件下，唑尼沙胺與羥苯甲酯（內標）互不干擾且與血漿中內源性雜質分離良好，唑尼沙胺的保留時間約為4.551 min，羥苯甲酯的保留時間約為6.036 min。

2.7 標準曲線的繪制

空白血漿中加入唑尼沙胺標準溶液適量，再依次用空白血漿稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1系列的濃度，按“2.5”項下方法處理后進行高效液相測定，記錄色譜圖，將唑尼沙胺與內標的峰面積比值（R）對濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程：R = 1.45C – 6.09 × 103（r = 0.999 5，n = 9），線性范圍：0.1 ～ 40.0 μg·mL-1，最低定量限為0.1 μg·mL-1。

2.8 精密度和回收率實驗

空白血漿中加入唑尼沙胺標準溶液適量，配制成低、中、高三種不同濃度（0.2、2.0、20.0 μg·mL-1），按“2.5”項下方法處理后進樣，各濃度日內重復測定5次，并連續測定5 d，計算日內、日間的精密度和方法回收率，結果見表1。

2.9 穩定性考察

圖1 唑尼沙胺HPLC色譜圖A – 空白血漿，B – 標準血樣（含10 μg·mL-1的唑尼沙胺和8 μg·mL-1的羥苯甲酯)，C – 受試者服藥后6 h血漿樣品；1 – 唑尼沙胺，2 – 羥苯甲酯Fig 1 HPLC chromatograms of zonisamideA – blank plasma, B – standard plasma with zonisamide 10 μg·mL-1 and methylparaben 8 μg·mL-1, C – human plasma samples of the volunteer after oral administration with drugs for 6 h; 1 – zonisamide,2 – methylparaben

表1 精密度和回收率實驗測定結果. n = 5Tab 1 Test results of precision and recovery. n = 5

將加入唑尼沙胺的血漿樣品分別在– 65 ℃低溫冰箱凍存52 d、室溫放置3 h、血漿樣品反復凍融3次、血漿樣品經處理后在10 ℃放置28 h，其含量沒有明顯變化，詳見表2。

表2 穩定性實驗測定結果. μg·mL-1，x ± s，n = 9Tab 2 Test results of stability. μg·mL-1, x ± s, n = 9

2.1 0 數據處理

Cmax和tmax均以實測值表示；AUC0-t以梯形法計算，AUC0-∞按公式計算：AUC0-∞= AUC0-t+ Ct/λz（t為最后一次可實測血藥濃度的采樣時間；Ct為末次可測樣本血藥濃度；λz為對數藥-時曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數）；t1/2= 0.693/λz。藥動學基本參數的計算與統計學檢驗分析借助DAS 2.1.1軟件完成。

2.1 1 藥-時曲線

30名受試者單次口服（低劑量200 mg，中劑量300 mg，高劑量400 mg）唑尼沙胺分散片的血藥濃度均值-時間曲線見圖2，9名受試者多劑量口服唑尼沙胺（300 mg）后的平均血藥濃度-時間曲線見圖3。

圖2 單次口服唑尼沙胺200、300、400 mg后的平均藥-時曲線. n = 10Fig 2 Concentration-time curves after single oral administration of zonisamide with the dose of 200, 300, 400 mg. n = 10

圖3 多次口服唑尼沙胺300 mg后的平均藥-時曲線. n = 9Fig 3 Concentration-time curve after multiple dose administration of zonisamide 300 mg. n = 9

2.1 2 藥動學參數

30名健康受試者單劑量口服200、300、400 mg唑尼沙胺后測得血漿中的主要藥動學參數和9名健康受試者多劑量口服300 mg唑尼沙胺后測得血漿中的主要藥動學參數見表3。

表3 單劑量及多劑量口服唑尼沙胺后血漿主要藥動學參數測定結果. x± sTab 3 Determination results of main pharmacokinetic parameters of zonisamide in plasma after single or multiple oral administration. ±s

表3 單劑量及多劑量口服唑尼沙胺后血漿主要藥動學參數測定結果. x± sTab 3 Determination results of main pharmacokinetic parameters of zonisamide in plasma after single or multiple oral administration. ±s

參數單次給藥（n = 10） 300 mg多次給藥（n = 9 ）200 mg 300 mg 400 mg t1/2/h 78.276 ± 16.074 66.316 ± 11.585 66.971 ± 12.821 59.286 ± 8.882 tmax/h 3.300 ± 1.567 4.400 ± 2.875 5.200 ± 2.530 2.556 ± 0.726 C/μg·mL-1 2.699 ± 0.806 4.372 ± 0.899 6.668 ± 1.692 27.305 ± 5.201 max AUC/μg·h·mL-1 222.122 ± 47.188 386.182 ± 69.693 550.010 ± 181.734 2 522.230 ± 720.554 0-∞AUC/μg·h·mL-1 205.858 ± 45.684 368.021 ± 62.976 521.375 ± 165.537 2 435.713 ± 668.845 0-t C/μg·mL-1– – – 21.939 ± 4.440 min C/μg·mL-1– – – 24.197 ± 4.716 av AUC/μg·h·mL-1 – – – 580.722 ± 113.189 ss

2.1 3 藥品不良反應評價

實驗過程中共23例受試者出現藥品不良反應，具體表現為心慌、心跳加速、氣促、頭昏、嗜睡、乏力、運動失調、反應遲緩、注意力下降，未給予其他治療隨后自行緩解，屬輕度不良反應。

3 討論

3.1 方法與分析

紫外光譜顯示，唑尼沙胺吸收波長約為240 nm及284 nm，240 nm的吸收強度最大，為避免血漿內源性雜質的干擾，本文選擇284 nm作為測定波長。實驗中曾將甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、羥苯乙酯、羥苯甲酯作為內標，因羥苯甲酯在流動相及血樣處理所具有的酸性條件下性質穩定，并具有合適的保留時間，與唑尼沙胺及血漿內源性雜質分離良好，無干擾，且價廉易得，故將其作為內標。有文獻[6]報道，唑尼沙胺在人體單劑量及多劑量實驗中因濃度范圍相差較大，采用不同濃度范圍的定量標準曲線，考慮到其操作繁復，本實驗只需做同一標準曲線即能覆蓋絕大多數樣本，線性范圍為0.1 ～ 40.0 μg·mL-1（r = 0.999 5，n = 9）。方法學研究結果表明，該方法具有良好的精密度、準確度和靈敏度，實驗穩定性好，操作快捷、簡便，能夠滿足唑尼沙胺人體藥動學研究的需要。

3.2 藥動學分析

本實驗所得藥動學參數與文獻[6，8-9]報道類似，受試者服藥后2 ～ 6 h達到峰濃度。在200 ～ 400 mg劑量范圍內，唑尼沙胺的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax均與劑量呈線性關系。單次給藥數據顯示，3組劑量中男性Cmax均較女性明顯偏低，而男性t1/2明顯較女性延長。唑尼沙胺屬于磺胺衍生物，對紅細胞有較高的親和力，因男性血液中紅細胞含量較女性多，推測男性服藥后藥物與紅細胞結合較多，隨后藥物逐漸釋放消除，這可能是男性表現為峰濃度較低、消除較慢的原因。由于藥物與紅細胞的結合具有飽和性，當多次給藥后結合達到飽和狀態，性別間紅細胞含量的絕對差異被飽和效應所稀釋，使得唑尼沙胺300 mg每日1次，連續14 d給藥后的Cmax和t1/2性別間差異較單次給藥減小。多次給藥后平均積蓄因子R為（10.117 ± 1.927），提示該用藥方案給藥后唑尼沙胺在人體內有明顯的蓄積。單次給藥和多次給藥后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞存在顯著性差異，唑尼沙胺在連續給藥14 d后，可達穩態血藥濃度。

整個實驗過程由經《藥物臨床試驗管理規范》（GCP）培訓的臨床醫師和護士進行觀察，除輕度不良反應外，無嚴重不良事件發生，表明實驗藥物在實驗劑量下具有較好的安全性[10]。