養(yǎng)血清腦顆粒對血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

王宏英 劉 磊 譚 巖 方艷秋 (長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林 長春 307)

微循環(huán)功能障礙是導(dǎo)致血管性癡呆(VD)發(fā)生的原因之一〔1，2〕。養(yǎng)血清腦顆粒是在補(bǔ)血名方“四物湯”的基礎(chǔ)上加減而成。前期基礎(chǔ)研究顯示，養(yǎng)血清腦顆粒具有擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，改善大腦微循環(huán)，增加大腦供血供氧，降低血黏度，抑制血小板聚集，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等功能。臨床研究顯示養(yǎng)血清腦顆粒不但可以有效改善慢性腦供血不足引起的頭暈、頭痛、頭重等癥狀，同時對高血壓引起的頭痛頭暈、緊張性頭痛、抑郁癥引起的失眠健忘等療效確切〔3〕。海馬體是與學(xué)習(xí)記憶等高級功能有密切關(guān)系的重要功能區(qū)，對缺血低灌注損傷有易感性，海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白可能在VD的發(fā)病過程中具有重要作用〔4〕。凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax等改變最終可引起海馬區(qū)細(xì)胞凋亡〔5〕。本文擬觀察養(yǎng)血清腦顆粒對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織凋亡蛋白變化的影響，以期從凋亡角度闡明養(yǎng)血清腦顆粒對VD的防治作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 VD大鼠模型制備 健康雌性Wistar大鼠36只，鼠齡4～7個月，體重280～350 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供和喂養(yǎng)。隨機(jī)分為假手術(shù)組(正常對照組)、模型對照組(癡呆組)、養(yǎng)血清腦顆粒組。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的遠(yuǎn)近端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流。假手術(shù)組除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動脈外，其余過程與手術(shù)組相同。養(yǎng)血清腦顆粒組術(shù)前10 d及術(shù)后每天用養(yǎng)血清腦顆粒灌胃4.8 g/kg體重，共灌胃45 d。假手術(shù)組，模型對照組大鼠給予生理鹽水3 ml/d，1次/d灌胃。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 養(yǎng)血清腦顆粒浸膏(簡稱養(yǎng)血清腦顆粒，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z10960082)，由天士力制藥集團(tuán)提供，每克浸膏含生藥7 g，以蒸餾水將浸膏稀釋4.8 g/ml，每只大鼠給藥容積為10 ml/kg。SP染色試劑盒購于邁新公司;抗Bcl-2、抗Bax、抗β-actin、HRP標(biāo)記IgG，均為cell signaling產(chǎn)品;Morris水迷宮，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院治療所生產(chǎn)BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng)，PERIFLUX SYSTEM 5000激光多普勒血流儀，立體定位儀，牙科鉆。

1.3 記憶功能的測定 于造模后第15天采用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠記憶功能的測定〔6〕。實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段連續(xù)進(jìn)行4 d，每天訓(xùn)練2次，進(jìn)行Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。之后連續(xù)4 d進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，每日2次，計算平均成績。

1.4 HE染色 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠斷頭處死，立即剝離顱骨，將全部腦組織取出，置于4%多聚甲醛固定24 h，將充分固定好的腦組織切去嗅球及小腦，以乳頭體中部為切點(diǎn)，將腦冠狀切成2片，常規(guī)脫水，石蠟包埋。每份標(biāo)本選取海馬為觀察點(diǎn)，保證同一時間點(diǎn)各組標(biāo)本選取的位置一致，連續(xù)切片5張，片厚4 μm。石蠟塊切片進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.5 免疫組化方法檢測活化的caspase-3表達(dá) 使用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒，用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶及基質(zhì)色素混合液測定細(xì)胞和組織中的caspase-3(p20)。

1.6 Western印跡檢測Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)量變化 取大鼠的腦組織，立即放入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液中，冰上超聲勻漿后，4℃，12 000 r/min離心30 min，取上清，G250法測定總蛋白含量，將蛋白樣品濃度調(diào)整為40 μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜2 h，10%脫脂奶封閉液1 h。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗工作液(抗Bcl-2和Bax及抗β-actin抗體)，4℃振搖孵育過夜。TBST洗膜3次，加入1∶3 000稀釋的相應(yīng)二抗，室溫反應(yīng)1 h;TBST洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色，BandScan5.0分析軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶的灰度值與β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 海馬局部腦血流量(rCBF)測定〔7〕參照《大鼠腦立體定位圖譜》，應(yīng)用PERIFLUX SYSTEM 5000激光多普勒血流儀測定每只大鼠海馬腦血流量變化3～5 min，記錄LDP輸出信號，經(jīng)PERISOFT程序處理，計算平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS10.0軟件，計量資料以s表示，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析(one way ANOVA)，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠認(rèn)知功能比較 定位巡航試驗(yàn)中，模型組大鼠尋找平臺的潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P＜0.05)，而養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠尋找潛伏期與模型組比較明顯縮短(P＜0.05)。見表1。

表1 各組VD大鼠水迷宮潛伏期比較(n=6，s，s)

表1 各組VD大鼠水迷宮潛伏期比較(n=6，s，s)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與模型對照組比較:2)P＜0.05

組別 D3 D4 D5 D6假手術(shù)組 33.2±14.5 28.1±11.50 20.6±8.81 12.6±6.92模型對照組 104.4±27.31)94.4±25.21)72.9±17.21)54.4±14.31)養(yǎng)血清腦顆粒組 43.6±13.52)36.4±12.72)27.9±10.12)18.4±9.32)

2.2 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組的大腦皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞染色均一，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜、核膜清晰;神經(jīng)元數(shù)量多，體積大，核圓，核仁明顯。模型組大鼠大腦皮層及海馬可見神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞外空隙增大，多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞核呈固縮狀、胞質(zhì)深染、胞膜核膜界限不清晰，可見壞死的神經(jīng)元。養(yǎng)血清腦顆粒大鼠的大腦皮層及海馬神經(jīng)元數(shù)量較多，排列整齊，神經(jīng)元體積大，核圓，核仁明顯，偶見神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，少有神經(jīng)元壞死現(xiàn)象。見圖1。

圖1 大鼠海馬HE染色結(jié)果(×200)

2.3 養(yǎng)血清腦顆粒對VD大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)元活化的caspase-3表達(dá)的影響 假手術(shù)組海馬caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)很少，陽性反應(yīng)弱。模型對照組大鼠腦組織海馬有較多的caspase-3陽性(凋亡細(xì)胞)。養(yǎng)血清腦顆粒組與模型對照組相比，細(xì)胞陽性反應(yīng)顯著減弱(P＜0.05)，見圖2。

2.4 大鼠腦組織Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)量變化 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠海馬區(qū)的Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠海馬內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)水平與模型對照組相比明顯升高(P＜0.05)。模型對照組大鼠海馬區(qū)的Bax蛋白表達(dá)水平與假于術(shù)組大鼠相比顯著升高(P＜0.05);養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠海馬內(nèi)Bax蛋白表達(dá)水平與模型組相比明顯減低(P＜0.05)。見圖3。

圖2 大鼠海馬caspase-3陽性細(xì)胞(SP，×200)

圖3 大鼠腦組織Bcl-2，Bax蛋白的變化

2.4 大鼠海馬腦血流變化 與假手術(shù)組〔(35.21±5.53)PU〕比較，模型對照組大鼠海馬區(qū) rCBF〔(24.43±4.23)PU〕明顯降低，養(yǎng)血清腦顆粒可顯著提高大鼠海馬區(qū) rCBF〔(30.61±4.85)PU〕(P＜0.05)。

3 討論

VD是由于腦血管疾病引起的以學(xué)習(xí)認(rèn)知功能(即語言、視空間、定向力或抽象思維)減退的神經(jīng)性疾病。由于血管發(fā)病的危險因素是可以避免的，所以對VD盡早實(shí)施積極有效的藥物干預(yù)，對于緩解或減輕VD病人癥狀，甚至逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能障礙及損傷具有重要的意義〔8〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)下區(qū)域(包括腦室周圍白質(zhì)、基底節(jié)和海馬)腦血流量慢性持續(xù)性下降可能是導(dǎo)致VD的主要原因之一，這種認(rèn)知障礙經(jīng)過治療可以部分緩解。控制VD危險因素，特別是低灌注，可以防止VD的進(jìn)展〔9〕。

慢性腦灌注不足是VD發(fā)病的主要病因，故本研究采用2VO法致大鼠VD模型。利用Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VD大鼠出現(xiàn)持續(xù)性認(rèn)知功能障礙。研究顯示〔10〕，大鼠持續(xù)性腦血流量下降可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，凋亡是腦缺血時神經(jīng)細(xì)胞脫失的主要原因之一。本研究采用激光多普勒血流儀監(jiān)測大鼠額葉皮質(zhì)rCBF情況，結(jié)果顯示模型對照組腦血流量持續(xù)下降，同時大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，逃避潛伏期明顯延長。海馬是認(rèn)知功能相關(guān)的重要腦區(qū)，海馬神經(jīng)元的存活數(shù)量直接影響神經(jīng)元突觸的可塑性。研究認(rèn)為〔11〕，大鼠認(rèn)知改變與海馬CA1區(qū)凋亡有很強(qiáng)的相關(guān)性。在凋亡基因調(diào)控中，bcl-2家族起到重要調(diào)節(jié)作用，減少Bcl-2、增加Bax的表達(dá)可激活caspase-3和p53，進(jìn)一步誘發(fā)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡。我們通過免疫組化染色證實(shí)了慢性缺血可以引起海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞活化的caspase3表達(dá)增加，且隨著缺血時間的延長大鼠出現(xiàn)持續(xù)性認(rèn)知功能障礙，說明細(xì)胞凋亡參與慢性缺血致VD導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的過程。研究中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠腦組織均表達(dá)一定量Bcl-2與Bax，且二者比值保持相對平衡。養(yǎng)血清腦顆粒的應(yīng)用一定程度的增加了Bcl-2蛋白表達(dá)，降低了Bax蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡的作用。通過行為學(xué)也證實(shí)，改善凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)程度與學(xué)習(xí)記憶能力改善密切相關(guān)。

養(yǎng)血清腦顆粒為治療頭痛的三類中藥新藥，能較好改善眩暈、耳鳴、失眠、健忘等相關(guān)伴隨癥狀。藥物成分分析顯示，組方中含有的川芎嗪、阿魏酸、芍藥苷等物質(zhì)成分也有不同程度地抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血清腦顆粒在降壓的同時，能舒張血管，調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)，可以從炎癥相關(guān)基因、血管擴(kuò)張相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因等多方面影響腦基因表達(dá)譜。本研究揭示養(yǎng)血清腦顆粒可以增加大鼠海馬區(qū)rCBF，抑制由于缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠認(rèn)知功能，可能是防治慢性腦缺血所致VD認(rèn)知功能障礙的有效手段。

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