siRNA靶向沉默Smad7對PC12細胞氧糖剝奪敏感性的影響

王一鳴 程 也 付丹陽 王勇濤 王姣琦 梅春麗 莽 靖 徐忠信

(吉林大學白求恩醫學部臨床醫學院，吉林 長春 130021)

腦缺血性損傷后神經細胞內可發生一系列信號轉導通路變化并產生相應生物學功能〔1〕。激活素A(Act A)通過跨膜受體介導細胞內Smads活化觸發下游級聯反應，發揮對神經細胞缺血缺氧性損傷的保護作用〔2～4〕。在Smads家族中，Smad2/3為Act AⅠ型受體(ActRⅠ)的直接底物，磷酸化激活后與Smad4形成復合物轉入細胞核內調控基因表達〔5〕。Smad7通過與Smad2/3競爭結合磷酸化的ActRⅠ，負性調控Act A/Smads通路活化〔6〕。本研究檢測神經元樣PC12細胞對缺血缺氧性損傷的敏感性及Smad3基因mRNA的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤)購自北京金紫晶生物醫藥技術有限公司(中國醫學科學院腫瘤細胞庫)。鼠神經生長因子(NGF)購自Sigma公司，兔抗大鼠Smad7抗體購自美國Santa公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自北京鼎國生物技術公司，UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購自天根生化科技有限公司。Smad3、7及內參GAPDH基因引物委托上海生工公司合成。

1.2 PC12細胞培養與神經元樣細胞轉化 PC12細胞于含15%馬血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中培養，2～3 d更換培養液，細胞接近80%融合時用0.25%胰酶消化傳代。對數生長期PC12細胞培養貼壁后加入 NGF(終濃度50 ng/ml)，連續刺激7 d誘導細胞神經元樣轉化〔5〕。

1.3 氧糖剝奪模型的建立 應用含10%胎牛血清和1.0 mmol/L Na2S2O4的無糖DMEM培養液培養神經元樣PC12細胞〔5〕。計時16 h，建立 OGD 16 h 組。

1.4 siRNA的設計合成 利用GenBank數據庫檢索大鼠Smad7 序列(NM030858.1)，參考 Reynolds等〔7〕的 siRNA 設計原則及國內外文獻設計siRNA序列。該siRNA設計靶點起始于1 435 bp，靶基因序列1:5'-aacgaucugcgcucguccggcgu-3';正義鏈 5'-aacgaucugcgcucguccggcgudtdt-3';反 義 鏈 3'-dtdtuugcuagacgcgagcaggccgca-5'。靶向Smad7基因的siRNA、Cy5標記的陽性siRNA及陰性對照siRNA委托吉凱公司合成。

1.5 siRNA瞬時轉染及分組 使用Cy5標記的陽性siRNA(siRNA-T)轉染PC12細胞，以確定siRNA轉染效率及最佳轉染濃度。按說明書步驟操作，24孔板內PC12細胞達到80%融合時進行轉染。選擇4個濃度梯度 siRNA-T(20，30，50，100 nmol/L)，分別于轉染24 h后觀察。選取轉染效率最高的siRNA濃度進行后續轉染實驗，分別轉染靶向Smad7基因的siRNA，陰性siRNA及對照PBS，建立陽性轉染組，陰性轉染組及空轉染組。陽性及陰性轉染組細胞于轉染24 h后OGD處理16 h。

1.6 實時RT-PCR檢測Smad3、7 mRNA表達 收集實驗各組細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，應用ABI7500Fast型實時熒光定量PCR儀對Smad3、7基因mRNA的表達進行檢測。基因引物見表1。檢測實驗重復3次，應用Relative Quantification(ddCt)Study進行相對表達量(RQ)分析，并以GAPDH基因為內參，計算Smad3、7 mRNA基因在不同組別之間的相對表達水平。

表1 引物序列和PCR產物長度

1.7 Western印跡檢測Smad7蛋白表達 收集陽性轉染組、陰性轉染組及空轉染組細胞，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，兔抗大鼠Smad7抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2 h，ECL顯影壓膠片。

1.8 4，6-二脒基-乙苯基吲哚(DAPI)染色細胞凋亡檢測 將3組細胞接種于預先放有爬片的24孔板，陽性及陰性轉染組細胞經OGD 16 h處理后收集細胞爬片進行DAPI(100 ng/ml)染色，避光條件下37℃作用20 min后封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 統計學分析 采用SPSS10.0統計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結果

2.1 轉染效率觀察 轉染24 h后，隨著siRNA濃度升高轉染效率逐漸增加(均大于70%)。但siRNA 100 nmol/L組的轉染效率與50 nmol/L組無差別，故siRNA轉染的最佳濃度為50 nmol/L。見圖1。

2.2 Smad7 mRNA的表達檢測 與陽性轉染組Smad7 mRNA表達水平(0.32±0.13)比較，陰性轉染組(0.68±0.14)和空轉染組(0.73±0.11)明顯增高(P＜0.05)。

2.3 Smad7蛋白水平的表達檢測 陽性轉染組Smad7蛋白表達水平(0.32±0.16)與陰性轉染組(0.99±0.12)及空轉染組(1.00±0.14)相比明顯降低(P＜0.05)，超過 67.0%(見圖2)。

圖1 陽性siRNA(50 nmol/L)轉染24 h后明暗場攝片

2.4 DAPI染色細胞凋亡檢測 靶向沉默Smad7聯合OGD 16 h組凋亡細胞比例(10.67%±0.25%)較陰性轉染聯合OGD 16 h 組(20.44%±0.87%)顯著減少(見圖3)。

2.5 Smad3 mRNA的表達檢測 陽性轉染聯合OGD 16 h組Smad3 mRNA表達水平(1.51±0.15)與陰性轉染聯合OGD 16 h組(0.90±0.13)相比明顯升高(P＜0.05)，陰性轉染聯合 DGD 16 h 組與空轉染組(0.53±0.18)比較有顯著差異(P＜0.05)。

圖2 Smad7蛋白的表達檢測

圖3 靶向沉默Smad7細胞凋亡的變化(×400)

3 討論

Smad蛋白根據其在轉化生長因子(TGF)-β家族信號轉導通路中的作用分為:通用Smad(Co-Smads)、抑制性Smads(ISmads)和膜受體激活的Smads(R-Smads)。目前已知的Co-Smad 僅有 Smad 4;R-Smads包括 Smad 1、2、3、5 和8;I-Smads包括Smad6和7，在TGF-β信號通路中發揮負性調節功能〔8〕。在經典研究中Smad7具有與R-Smads競爭結合TGF-βⅠ型受體，促進 TGF-βⅠ型受體的去磷酸化和降解的功能〔6，8，9〕。

本研究說明抑制Smad7基因表達可降低OGD對PC12細胞的損傷，提高細胞對缺血缺氧的耐受性。此外，Smad7基因沉默對PC12細胞缺血缺氧的保護作用是通過上調Act A通路下游主要位點Smad3基因的表達來實現的。

近期研究發現，作為I-Smad的一員，Smad6除了在胞質中發揮負性調控功能外，還在細胞核內具有下調TGF-β信號轉導通路活化的功能〔10〕。Zhang等〔11〕發現 Smad7具有結合核內DNA，干擾功能性Smads-DNA復合物形成，抑制TGF-β通路的功能。推測細胞核內Smads-DNA復合物對Act A/Smads通路活化具有正反饋調節作用，沉默Smad7可能通過提高Smads-DNA功能進而促進Smad3轉錄。

1 Mukerji SS，Katsman EA，Wilber C，et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2007;27(6):1161.

2 Schmierer B，Hill CS.TGF beta-SMAD signal transduction:molecular specificity and functional flexibility〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2007;8(12):970.

3 He JT，Mang J，Mei CL，et al.Neuroprotective effects of exogenous activin A on oxygen-glucose deprivation in PC12 cells〔J〕.Molecules，2011;17(1):315-27.

4 Mang J，Mei CL，Wang JQ，et al.Endogenous protection derived from activin A/Smads transduction loop stimulated via ischemic injury in PC12 cells〔J〕.Molecules，2013;18(10):12977-86.

5 Wang JQ，He JT，Du ZW，et al.Effects of SARA on oxygen-glucose deprivation in PC12 cell line〔J〕.Neurochem Res，2013;38(5):961-71.

6 Shi W，Sun C，He B，et al.GADD34-PP1c recruited by Smad7 dephosphorylates TGFbeta type Ⅰ receptor〔J〕.J Cell Biol，2004;164(2):291-300.

7 Reynolds A，Leake D，Boese Q，et al.Rational siRNA design for RNA interference〔J〕.Nature Biotechnol，2004;22(3):326-30.

8 Kato S，Ueda S，Tamaki K，et al.Ectopic expression of Smad7 inhibits transforming growth factor responses in vascular smooth muscle cells〔J〕.Life Sci，2001;69(22):2641-52.

9 Ebisawa T，Fukuchi M，Murakami G，et al.Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta typeⅠreceptor through Smad7 and induces receptor degradation〔J〕.J Biol Chem，2001;276:12477-80.

10 Jung SM，Lee JH，Park J，et al.Smad6 inhibits non-canonical TGF-β1 signalling by recruiting the deubiquitinase A20 to TRAF6〔J〕.Nat Commun，2013;4:2562.

11 Zhang S，Fei T，Zhang L，et al.Smad7 antagonizes TGF-β signaling in the nucleus by interfering with functional Smad-DNA complex formation〔J〕.MCB，2007;27(12):4488-99.