絲膠對糖尿病大鼠腎臟轉化生長因子-β1表達的影響

張 艷 李 劍 陳 程 宋成軍 陳志宏 (承德醫學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000)

轉化生長因子-β1(TGF-β1)在腎臟表達最為豐富，而腎臟也是其作用的主要靶器官，多種因素可通過TGF-β1介導導致腎小球或是腎間質的損傷〔1〕。糖尿病時，高血糖、糖基化終末產物、蛋白激酶C、脂代謝紊亂和血管緊張素Ⅱ等多種因素均可激活TGF-β1，導致腎臟TGF-β1的表達水平升高，從而參與糖尿病腎臟損傷的發生發展〔2～4〕。本研究通過觀察糖尿病模型大鼠腎臟TGF-β1表達的變化，探討蠶繭提取物——絲膠保護糖尿病腎臟損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗用試劑和藥品 絲膠(承德醫學院蠶業研究所)，經浸泡、水煎、濃縮獲得。鏈脲佐菌素(STZ)美國Sigma公司，臨用時用pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%的溶液;血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司;尿素氮、肌酐檢測試劑盒，北京首醫臨床科技中心;兔抗TGF-β1多克隆抗體，美國Santa公司;SP免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗動物的選擇、分組、處理 48只3月齡清潔級健康雄性SD大鼠，體重200～250 g(合格證號:712024)，由河北醫科大學實驗動物中心提供。隨機選取其中的12只作為正常對照組，常規飼養，腹腔注射同等劑量STZ溶劑(pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)3次(1次/d);其余的36只大鼠小劑量STZ連續腹腔注射(2%STZ，25 mg/kg，3 d)，7 d后檢測空腹血糖，以≥16.7 mmol/L作為2型糖尿病動物模型成功的標準〔5〕;然后再隨機分為糖尿病模型組、絲膠治療組和陽性對照組(n=12)，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃 35 d，陽性對照組給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予同等劑量的生理鹽水35 d。

1.3 檢測血液指標 各組大鼠用藥結束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經內眥取血后3 000 r/min離心20 min，收集血清-20℃保存。使用日本日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖、谷氨酸脫氫酶兩點法檢測尿素氮、酶法檢測肌酐。

1.4 腎臟TGF-β1表達的檢測及定量分析 大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入Bouins固定，常規石蠟包埋、切片，片厚5 μm。SP免疫組化法檢測腎臟TGF-β1蛋白的表達:TGF-β1一抗1∶100稀釋，4℃過夜，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染;以PBS代替一抗作為陰性對照，TGF-β1陽性產物位于細胞質。采用MiVnt圖像分析系統進行定量分析:在高倍鏡下(10×40)選取腎小球，計算陽性產物面積占腎小球面積的比值;每只大鼠選取3張切片，每張切片選擇3個腎小球，取平均值作為TGF-β1的相對表達水平。

1.5 統計學方法 應用SPSS15.0統計學軟件處理數據，行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖、尿素氮和肌酐 糖尿病模型組大鼠的血糖、尿素氮和肌酐明顯高于正常對照組大鼠(P＜0.01);絲膠治療組、陽性對照組大鼠的血糖、尿素氮和肌酐明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01，P＜0.05)，且絲膠治療組與陽性對照組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血液指標和腎臟TGF-β1的表達(s，n=12)

表1 各組大鼠血液指標和腎臟TGF-β1的表達(s，n=12)

與糖尿病模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)腎臟TGF-β1正常對照組 10.83±2.031)5.33±1.031)20.75±3.651)0.065±0.0091)糖尿病模型組 29.45±4.82 11.13±2.70 38.17±8.77 0.104±0.016絲膠治療組 13.20±4.091)7.51±2.421)28.11±2.801)0.071±0.0111)陽性對照組 13.18±2.301)8.71±2.232)32.03±6.312)0.074±0.0101)

2.2 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達 TGF-β1蛋白免疫陽性產物呈棕黃色細膩顆粒狀，位于腎小囊壁層上皮細胞、足細胞和球內系膜細胞的胞質。與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達明顯升高(P＜0.01);絲膠治療組、陽性對照組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01)，且絲膠治療組與陽性對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(DAB，×400)

3 討論

本研究發現，糖尿病模型大鼠的腎功能明顯下降，腎臟TGF-β1蛋白的表達明顯升高。TGF-β1的表達水平升高主要通過增加細胞外基質(ECM)的產生和促進腎臟肥大參與糖尿病腎臟損傷的病理過程:①促進腎臟肥大:TGF-β1可通過調節細胞周期蛋白激酶抑制劑的表達和活性，阻止細胞從G1期過渡到S期，導致細胞蛋白質和RNA合成增多，從而促進腎臟肥大〔6〕。②促進ECM積聚:TGF-β1可直接促進ECM成分增加，如膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ及纖維連接蛋白等〔7〕;TGF-β1還可以抑制膠原酶的合成，阻止參與ECM降解的金屬蛋白酶的合成，以及通過增加激活劑蛋白-1(AP-1)的分泌、抑制纖溶酶級聯反應系統對ECM 的降解，促進 ECM 聚集〔8，9〕。

當前治療糖尿病的方法有藥物治療、注射胰島素、細胞移植和基因治療等，但以藥物治療為主。目前，國內外用于糖尿病治療的藥物有以下幾種:磺脲類、雙胍類、α-糖苷酶抑制劑類、胰島素增敏劑類等，各類藥物雖能較好地控制血糖，延緩病情惡化及并發癥的發生，但大多藥物均有不同程度的副作用，大多無法改善胰島素抵抗及有效保護胰島細胞，且長期使用易產生不良反應及耐藥性〔10，11〕。正是西藥的毒副作用促使我們尋找一種降糖療效可靠且毒副作用無或極少的治療糖尿病的中成藥，因此我們選擇了絲膠。

糖尿病屬中醫學“消渴癥”的范疇，治療原則是生精清熱、潤燥養陰。蠶繭是蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，可滋陰潤燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消，我國民間早有蠶繭泡水控制血糖的驗方。我國應用蠶絲有幾千年的歷史，但主要是將絲素用作衣料，約占繭絲30%的絲膠一直作為廢料丟棄;為了有效利用如此大量優質的蛋白質，學者們開發了絲膠許多新的功效，如美容、護膚、營養、抗氧化、抗癌等〔12，13〕。但關于絲膠治療糖尿病及其并發癥的研究，僅有本課題組進行了初步探討，發現絲膠可改善糖尿病時血脂代謝紊亂、減少胰島細胞凋亡及減輕糖尿病時生殖功能障礙〔14～16〕。本研究發現，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達;本研究表明，絲膠可通過下調腎臟TGF-β1蛋白的表達，抑制 TGF-β1促進腎臟肥大的作用及減輕腎臟ECM積聚，從而減輕腎臟肥大和ECM進行性加重導致的腎小球硬化、腎間質纖維化，因此絲膠可有效保護糖尿病時的腎臟損傷，并且由于絲膠是天然的蛋白質，可避免化學合成藥物帶來的毒副作用。但絲膠是否可通過其他途徑保護糖尿病腎臟損傷，有待于進一步的深入研究。

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