他克莫司對IgA腎病模型大鼠腎臟的影響

劉寶玲 劉 冰 陳 志 孫珉丹 (一汽總醫院腎內科，吉林 長春 300)

IgA腎病是以IgA沉積為主，伴或不伴IgG、IgM及C3沉積為特征的一類腎小球腎炎，是導致終末期腎臟病(ESRD)的最常見的原發性腎小球疾病之一〔1〕。他克莫司(普樂可復)是一種新型高效的免疫抑制劑，主要治療器官移植后的抗排斥反應〔2〕以及自身免疫性疾病，有關其在腎病領域的研究主要集中在狼瘡性腎炎〔3〕及早期膜性腎病。本實驗探討牛血清白蛋白(BSA)聯合脂多糖(LPS)制備IgA腎病模型大鼠及普樂可復防治IgA腎病的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級6周齡雄性Wistar大鼠50只，體重(200±20)g，購自吉林大學白求恩醫學院動物實驗室。所有大鼠實驗前尿紅細胞計數及尿蛋白定性試驗均呈陰性(尿沉渣計數法、試紙條法)，排除動物因素對實驗結果的影響。

1.2 材料及主要儀器 BSA來自瑞典進口分裝，LPS為美國Sigma公司產品，四氯化碳(CCl4)及蓖麻油購自天津化學試劑廠，普樂可復出自 Astellas Ireland Co.，Ltd.Killorglin，Co.Kerry，貝那普利由北京諾華制藥有限公司惠贈。SP免疫組化試劑盒、AEC顯色試劑盒及DAB顯色試劑盒均由福州邁新生物技術有限公司生產。熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司，型號BX51。

1.3 動物分組、IgA腎病模型的制備以及給藥方法 大鼠隨機分為正常對照組10只，造模組40只。正常對照組從實驗開始第1天起給予4 ml/kg的蒸餾水隔日灌胃1次，共8 w;皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.4 ml/只，每周1次，持續9 w;于第6周經尾靜脈注射0.9%NaCl 0.2 ml/只。第10周起，給予4 ml·kg-1·d-1蒸餾水灌胃，1次/d。IgA腎病模型制備根據陸慧渝等〔4〕方法及預實驗結果，將BSA以蒸餾水配成100 g/L的濃度，從實驗第1天開始以 BSA 400 mg/kg灌胃，隔日1次，共8 w;皮下注射 CCl40.1 ml+蓖麻油 0.3 ml，1 次/d，共 9 w;于第6周尾靜脈注射LPS 0.05 mg/只。第9周隨機選取造模組8只及正常對照組2只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠取腎組織經蘇木素伊紅染色(HE)及免疫組化觀察證實IgA腎病造模成功后隨機分為4組，每組8只。自第9周起，正常對照組給予4 ml·kg-1·d-1蒸餾水灌胃，1次/d;模型組給予蒸餾水4 ml·kg-1·d-1灌胃，1次/d;貝那普利組給予貝那普利 10 mg·kg·d-1，每日灌胃1次;普樂可復組給予普樂可復4 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次。貝那普利+普樂可復組:以普樂可復4 mg·kg-1·d-1+貝那普利10 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次;以上各組均持續至12 w末，以10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，無菌操作下摘除左腎，切取部分腎組織，置于10%甲醛中固定做光鏡檢查及免疫組織化學檢查。

1.4 常規HE染色 將留取的大鼠腎組織置于4%中性甲醛固定液中固定48 h，常規脫水，透明，包埋，將蠟塊切成2～3 μm的切片，進行HE染色，主要觀察腎組織內的細胞成分和形態特點。光鏡下觀察腎組織病理改變，攝片。

1.5 SP免疫組織化學方法檢測IgA的定位和表達 石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，自來水沖洗，蒸餾水沖洗。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min。每張切片滴加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加非免疫動物血清，室溫下孵育10 min。滴加兔抗大鼠IgA抗體(1∶200)于組織切片上，4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標記的第二抗體于組織切片上，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加鏈霉素抗生物-過氧化物酶溶液于組織切片上，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加AEC顯色液(現用現配)于切片上，顯微鏡下觀察至顯色滿意，自來水沖洗，蘇木素復染，流水沖洗反藍。水性封片劑封片，顯微鏡下觀察攝影。

2 結果

2.1 光鏡組織學改變 光鏡下可見正常對照組腎小球系膜細胞及基質無增生，毛細血管襻開放良好，腎小球無萎縮，腎小管結構基本規則，未見間質增生及炎細胞浸潤;模型組多數腎小球系膜細胞和系膜基質彌漫性中度增生，腎小球基底膜節段性增厚，腎小球內少量炎細胞浸潤，偶見球囊粘連和節段硬化，毛細血管管壁增厚，管腔中度狹窄，腎小管間質有較多炎細胞浸潤，部分腎小管擴張，灶狀腎小管萎縮;貝那普利組、普樂可復組腎小球系膜細胞、系膜基質輕度彌漫增生，腎小球內偶見炎細胞浸潤，毛細血管管腔輕度狹窄，腎小管間質可見少量炎細胞浸潤，腎小管管腔部分開放尚好。貝那普利+普樂可復組腎小球毛細血管襻開放尚好，系膜細胞、系膜基質輕度彌漫增生，腎小球基底膜未見明顯增厚，腎小球內未見炎細胞浸潤，間質偶見炎細胞浸潤，腎小管小灶狀輕度萎縮，偶見管型(見圖1)。

2.2 免疫組組織化學法測定IgA表達 顯微鏡下可見除正常對照組外，各組大鼠腎小球系膜區和毛細血管棕黃色顆粒狀及團塊狀的沉積，提示IgA腎病造模成功;模型組可見腎小球系膜區及毛細血管襻棕黃色強陽性染色區，個別呈團塊狀;各治療組腎小球系膜區內IgA棕黃色強度較模型組稍弱，以貝那普利組+普樂可復組強度最弱(見圖2)。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色(×400)

圖2 各組大鼠腎臟組織IgA沉積強度(×400)

3 討論

Berger等〔5〕首先報道了 IgA腎病，隨后國內外眾多學者〔6〕通過對其發病機制、流行病學、病理與臨床、治療及預后等方面的深入研究，認為主要是IgA為主的免疫復合物，伴或不伴IgG、IgM及C3，在腎小球系膜細胞和基質沉積，激活多種細胞因子及促發免疫反應過程，從而導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化，最終引起腎衰竭。因此，如何抑制系膜基質沉積是延緩IgA腎病進展、改善預后的關鍵所在，也是治療的靶點之一。

普樂可復是一種新型高效的免疫抑制劑，已應用于臨床多種器官移植，免疫抑制效果良好〔7，8〕，主要是通過抑制 T細胞活化以及Th輔助細胞依賴型B細胞增生及抑制細胞因子IL-1～4、9、10等及干擾素(IFN)-γ的生成及 IL-2R的表達，從而發揮免疫抑制效應〔9～11〕，其抑制混合淋巴細胞反應能力較環孢素A大10～100倍〔12〕。在分子水平，普樂可復與T細胞內特異性受體蛋白(胞質結合蛋白-FKBP12)結合，形成復合物(普樂可復-FKBP12)，競爭性抑制普樂可復與鈣調素的結合，使鈣調素介導的信號傳遞系統受到抑制，阻斷IL-2轉錄及抑制T細胞活化，從而發揮免疫抑制作用〔13〕。

1 王海燕.腎臟病學〔M〕.第3版.北京:人民衛生出版社，2009:993.

2 Pirsch JD.FK506 Kidney Transplant study group.A comparison of tacrolimus(FK506)and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation〔J〕.Transplantation，1997;15;63(7):977-83.

3 陳 強，劉志紅，胡偉新，等.普樂可復治療Ⅳ型狼瘡性腎炎的前瞻性臨床研究〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，2002;11(4):301-6.

4 陸慧渝，張巧玲，蔣小云，等.IgA腎病大鼠模型的建立〔J〕，中國誤診學雜志，2011;11(6):1264-7.

5 Berger J，Hingais N.Intercapillary depsits of IgA-IgG〔J〕.J Urol Nephrol(Paris)，1968;74(9):694-5.

6 余英豪，鄭智勇，姚麗清.腎穿刺活檢病理診斷彩色圖譜〔M〕.福建:福建科學技術出版社，2008:63-721.

7 Starzl TE，Todo S，Fung J，et al.FK506 for liver，kidney and pancreas transplantation〔J〕.Lancet，1989;2:1000-4.

8 Pirsch JD.FK506 kidney Transplant Study Group.A comparison of tacrolimus(FK506)and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation〔J〕.Transplantation，1997;63(7):977-83.

9 Dumont FJ.FK506，an immunosuppressant targeting calcineurin function〔J〕.Curr Med Chem，2000;7(7):731-48.

10 Denys A，Allain F，Masy E，et al.Enhancing the effect of secreted cyclophilin B on immunosuppressive activity of cyclosporine〔J〕.Transplantation，1998;65(8):1076-84.

11 Unere NA，Stevenson P，Schafer A.Pharmacokinetics of tacrolimus:clinically relevant aspects〔J〕.Transplant Proc，1999;31(7A):21S-4.

12 Hutchinson IV.The mode of action of prograf(tacrolimus)and its significance for long term graft survival〔J〕.New Horizons Kidney Transpl，1997;12(1):22-6.

13 傅 鵬，于 光，許 靜，等.來氟米特聯合激素延緩進展型IgA腎病腎功能減退的臨床研究〔J〕.臨床內科雜志，2006;23(11):731-3.