六味地黃丸含藥血清對軟脂酸誘導人臍靜脈內皮細胞損傷抗氧化的機制

于 洋 趙丹玉 王艷杰 馮曉帆 楊雪峰 張瑞鵬 柳 春

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院生化教研室，遼寧 沈陽 110032)

目前，糖尿病(DM)已成為第三大危害人類健康的全球性慢性疾病。其中胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的發病基礎〔1〕。IR即胰島素作用的靶器官對胰島素的敏感性下降，從而使葡萄糖的利用能力降低。研究證明，組織和細胞對胰島素的攝取和利用能力下降與血管內皮細胞功能不全(ECD)同時存在〔2〕。細胞代謝過程會產生各種活性物質，DM脂代謝紊亂時，氧化系統的作用超過抗氧化系統的清除能力，造成氧化應激反應〔3〕。六味地黃丸(LWDHP)被譽為“補陰方藥之祖”，具有抗氧化、降糖降脂之功效，臨床應用其治療DM取得良好的療效〔4〕。本實驗以軟脂酸(PA)誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)建立IR模型，探討LWDHP含藥血清對內皮細胞損傷抗氧化的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國藥準字Z19993068);胰島素，PA，噻唑藍(MTT)，Sigma公司;DMEM 培養基，胎牛血清，美國 HyClone公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，二甲基亞砜(DMSO)，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;兔抗人還原型輔酶素(NADPH)氧化酶4(NOX4)一抗，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，美國Proteintech Group公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司;RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司;二甲雙胍(MET)，上海生工生物工程有限公司;總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒，丙二醛(MDA)檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所。其他試劑均為國產分析純。

1.2 LWDHP含藥血清的制備 52只SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量300～350 g，雌雄各半，購自遼寧長生生物技術有限公司(許可證號:SCXK(遼)2010-0001)。標準環境下分籠喂養，早晚各喂食1次，換水1次/d，自由飲水進食，晝夜自然采光，室溫16℃ ～25℃，相對濕度60%。適應性喂養3 d后，按隨機數字法分為兩組，正常對照組34只，LWDHP中藥組18只。中藥組給予LWDHP粉末水溶液(生藥質量濃度為15 g·kg-1·d-1)灌胃，3 ml/次/只，2次/d，正常對照組給予等體積的生理鹽水，連續灌胃5 d。第6天于末次給藥1～2 h后10%水合氯醛腹腔麻醉(1.5 ml/只)，腹主動脈采血，分離血清，56℃滅活30 min，過濾除菌、分裝、封口、-80℃保存備用。

1.3 細胞培養及模型的建立 取對數生長期的EA.hy926 HUVEC(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)用含10%胎牛血清的DMEM培養基調整密度0.5×105個/ml接種于96孔培養板中，200 μl/孔，分為正常對照組、模型組、LWDHP治療組(2.5%、5%、10%含藥血清)、MET組，每組6個復孔，于37℃，5%CO2的孵育箱中培養。待細胞90%生長融合后，LWDHP治療組換成不同濃度梯度含大鼠血清的DMEM培養基，MET組加入MET(終濃度2 mmol/L)，繼續培養24 h。加入PA(終濃度為400 μmol/L)孵育1 h后，再加入胰島素(終濃度50 nmol/L)。PA作用細胞24 h后，加入MTT(5 mg/ml)，20 μl/孔，4 h 后加 DMSO(150 μl/孔)震蕩細胞15 min，酶標儀檢測OD值(490 nm)，計算細胞存活率。

1.4 總SOD活性和MDA含量檢測 細胞于96孔培養板中正常培養，分為正常對照組、模型組，5%LWDHP含藥血清治療組、MET組，每組6個復孔。LWDHP含藥血清，MET及PA處理細胞的方法同1.3。細胞處理后棄去培養基，按1×106個/ml細胞加入0.1 ml的RIPA裂解液(含10 μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF)，1 600 r/min離心10 min取上清液，嚴格按照檢測試劑盒的操作步驟檢測細胞裂解液中總SOD活性和MDA含量。

1.5 RT-PCR測定細胞NOX4 mRNA表達 將細胞按5×105個/ml密度接種到25 cm2培養瓶內，每瓶加4 ml培養基，分組同1.4。各組細胞藥物處理后，收集細胞提取細胞總RNA，分別測定OD260和OD280值并計算其比值以鑒定RNA純度。隨后用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄及聚合酶鏈反應。

β-actin上游引物序列:5'-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3'，下游引物序列:5'-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3'，擴增片段長度153 bp。反應條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40 個循環。NOX4 上游引物序列:5'-CAGGAGGGCTGCTGAAGTATCAA-3'，下游引物序列:5'-TGACTGGCTTATTGCTCCGGATA-3'，擴增片段長度303 bp。反應條件:退火68℃，30個循環。

PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統進行分析，以NOX4條帶光密度值和對應的β-actin條帶光密度值的比值表示NOX4 mRNA的表達量。

1.6 Western印跡測定細胞NOX4蛋白表達 細胞分組加藥處理后，收集細胞提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各樣本蛋白濃度。調整各組的蛋白質上樣量(40 μg)，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺粒膠(SDS-PAGE)電泳分離，電轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜。HRP標記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，37℃水浴震蕩2 h，DAB顯色，掃描條帶，ImageJ2x軟件進行灰度值分析，以GAPDH作為內參，NOX4和GAPDH蛋白表達強度進行灰度比值顯示NOX4表達水平。

2 結果

2.1 LWDHP含藥血清對PA損傷的HUVEC增殖的影響 模型組細胞的存活率是 60.62%(OD 值0.75±0.04)，與正常對照組(OD 值1.24±0.05)比較有顯著性差異(P＜0.01)。用不同濃度的LWDHP含藥血清對細胞進行干預保護，2.5%含藥血清，HUVEC 的存活率只有 31.67%，OD 值 0.39±0.03;5%、10%含藥血清組和 MET組細胞存活率分別為 77.46%、130.87%和 102.46%，OD 值分別為 0.96±0.03、1.62±0.02 和1.27±0.11，均明顯高于模型組(P＜0.01)。

2.2 LWDHP含藥血清對PA損傷的HUVEC總SOD活性的影響 PA損傷的細胞裂解液中總 SOD活性下降〔(48.42±4.06)U/ml〕，與正常對照組〔(67.41±4.08)U/ml〕比較差異顯著(P＜0.01)。5%LWDHP 含藥血清〔(63.46±2.67)U/ml〕和MET〔(64.27±3.24)U/ml〕能顯著增加 PA 損傷 HUVEC 的總SOD活性，其改善作用與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.3 LWDHP含藥血清對PA損傷的HUVEC MDA含量的影響 PA損傷的細胞裂解液中脂質氧化終產物MDA含量〔(0.748±0.048)μmol/L〕增高，與正常對照組 〔(0.346±0.031)μmol/L〕比較差異顯著(P＜0.01)。5%LWDHP 含藥血清〔(0.576±0.016)μmol/L〕和 MET〔(0.540±0.022)μmol/L〕能顯著降低MDA含量，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.4 各組NOX4 mRNA的表達 與正常對照組(0.545±0.000 4)比較，PA 組細胞內 NOX4 mRNA 的表達量(0.823±0.000 9)升高(P＜0.01)。與 PA 組比較，LWDHP 組(0.256±0.000 7)和 MET 組(0.545±0.000 7)細胞內 NOX4 mRNA 表達量下降(P＜0.01)。見圖1。

2.5 各組 NOX4蛋白的表達 與正常對照組(0.099±0.000 4)比較，PA組細胞內 NOX4蛋白的表達量(0.166±0.000 9)顯著升高(P＜0.01)。LWDHP 組(0.117±0.000 5)和MET組(0.139±0.000 5)與PA組比較，細胞內NOX4蛋白表達量均下降(P＜0.01)。見圖2。

圖1 各組HUVEC內NOX4 mRNA的表達比較

圖2 各組HUVEC內NOX4蛋白表達的比較

3 討論

DM是一種與遺傳因素和多種環境因素相關的以慢性高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征，目前認為DM的病理發病基礎之一是IR。IR是指胰島素作用的靶器官如肝臟、肌肉和脂肪組織等對一定量的胰島素作用敏感性下降，生物學反應低于正常水平，從而使葡萄糖利用減少，引起血糖水平升高。另外，IR會導致游離脂肪酸生成增多，沉積在血管內皮上，引起內皮細胞(EC)凋亡，導致 ECD〔5〕。

正常的EC不僅是血液和血管平滑肌之間的半透屏障，而且還是一個非常活躍的代謝和內分泌器官。細胞在代謝過程中會產生很多的高活性物質，其中的氧自由基作用于膜脂質發生過氧化反應，最重要的終產物之一為MDA，可通過測定MDA來了解細胞受損的程度〔6〕。體內氧自由基的產生有多種酶參與，其中NOX目前被認為是活性氧生成的關鍵酶，在NOX家族中，血管EC主要表達NOX4〔7〕。同時體內還存在抗氧化系統，最重要的是SOD，SOD能催化超氧化物陰離子發生歧化作用，生成過氧化氫和氧氣，是生物體內一種重要的抗氧化酶。如果氧自由基和抗氧化系統的動態平衡遭到破壞，氧自由基過度生成或清除減少，SOD的抗氧化能力下降，導致MDA顯著增加，細胞功能進一步受損〔8〕。本實驗說明細胞受損嚴重，膜的完整性遭到破壞，意味著PA可能通過NOX4途徑誘導HUVEC產生了氧化損傷。

近年研究表明，中醫藥在保護EC、預防EC損傷方面具有較為理想的調控效果，尤其是復方治療更具有優勢〔9〕。中醫認為氣虛陰虧是DM發生的基本病因病機，而LWDHP是滋補氣陰兩虛的傳統名方，臨床上用以治療DM顯現出明顯的優勢〔10〕。本實驗用不同濃度的LWDHP含藥血清對PA損傷的EC進行預保護，結果說明血清濃度太低，細胞生長的狀態比較差。大鼠血清本身就有刺激細胞增殖的效應，會掩蓋PA造模的效果，因此選定5%LWDHP含藥血清作為最佳治療濃度。

所以用5%LWDHP含藥血清進行后續實驗的干預后，能顯著增加PA損傷HUVEC的總SOD活性，降低MDA含量，同時能下調受損細胞的NOX4 mRNA和蛋白表達，證明LWDHP能降低PA對HUVEC的氧化損傷程度，增強抗氧化酶的活性，改善受損的EC狀態，提示LWDHP可能通過抑制NOX4的表達進而發揮它的抗氧化功效。

1 Mather KJ，Steinberg HO，Baron AD.Insulin resistance in the vasculature〔J〕.J Clin Invest，2013;123(3):1003-4.

2 Rubin RC.Insulin resistance.What it is and why it matters〔J〕.Diabetes Self Manag，2013;30(2):29-30，32.

3 Ren CJ，Zhang Y，Cui WZ，et al.Progress in the role of oxidative stress in the pathogenesis of type 2 diabetes〔J〕.Sheng Li Xue Bao，2013;65(6):664-73.

4 翁立元.關于六味地黃丸加減治療糖尿病的探究〔J〕.時珍國醫國藥，2013;24(4):874-5.

5 Turenkov IN，Voronkov AV，Slietsans AA.Role of endothelial dysfunction in the development of vascular complications of diabetes〔J〕.Patol Fiziol Eksp Ter，2013;(2):80-4.

6 Galhardi F，Mesquita K，Monserrat J M，et al.Effect of silymarin on biochemical parameters of oxidative stress in aged and young rat brain〔J〕.Food Chem Toxicol，2009;47(10):2655-260.

7 Venkatesan B，Valente AJ，Das NA，et al.CIKS(Act1 or TRAF3IP2)mediates high glucose-induced endothelial dysfunction〔J〕.Cell Signal，2013;25(1):359-71.

8 Kim CH.Expression of extracellular superoxide dismutase protein in diabetes〔J〕.Arch Plast Surg，2013;40(5):517-21.

9 徐娟萍，張曉峰.氧化低密度脂蛋白致血管內皮損傷機制及中藥復方防治的研究進展〔J〕.現代藥物與臨床，2011;26(3):195-8.

10 馮興中，尹英杰，姜 敏，等.六味地黃湯治療2型糖尿病腎陰虛證與非腎陰虛證的臨床實驗研究〔J〕.中華中醫藥雜志，2012;27(11):2995-9.