大孔樹(shù)脂層析－酸性氧化鋁吸附法制備蛇床子素工藝研究

孫士青，史建國(guó)，馬耀宏，楊俊慧

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南250014)

蛇床子素(osthole)化學(xué)名為甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是中藥蛇床子(Cnidium monnieri(L.)Cuss.)中含量最高的一種香豆素類(lèi)有效成分。現(xiàn)代藥理研究表明，蛇床子素具有抗高血壓、抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松、抗炎以及抗變態(tài)反應(yīng)等功效［1］。

高純度蛇床子素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%以上)的制備是研發(fā)一類(lèi)創(chuàng)新藥物的必需物質(zhì)基礎(chǔ)，目前報(bào)道的蛇床子素的提取可采用溶劑法、酸堿法、超聲法及超臨界萃取法等［2－4］。但是，能夠在工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)際應(yīng)用的提取方法主要是采用通用提取裝置的溶劑法。超聲法、超臨界萃取法都需要專(zhuān)用的提取設(shè)備，成本高、通用性差且維護(hù)保養(yǎng)難度大，難以大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。酸堿法對(duì)設(shè)備腐蝕性強(qiáng)、環(huán)境污染壓力大，屬于行業(yè)限制采用的提取法。分離蛇床子素主要有重結(jié)晶法、包結(jié)重結(jié)晶法以及色譜法等［5－7］，由于蛇床子素特殊的親酯性使得分離蛇床子素需采用的重結(jié)晶溶劑以及色譜洗脫溶劑多為氯仿、苯、甲醇和石油醚等有毒、有害、易燃和易爆試劑［2－3］。如果在藥品生產(chǎn)過(guò)程中使用以上試劑，不僅對(duì)環(huán)境安全、人員健康有嚴(yán)重危害，而且有毒試劑在所制備的藥品中的殘留量也將成為新藥審評(píng)中難以克服的問(wèn)題。本文采用大孔樹(shù)脂層析結(jié)合酸性氧化鋁吸附法分離蛇床子素，僅用乙醇為提取溶劑，而將經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂除去了親脂性雜質(zhì)的總香豆素類(lèi)化合物吸附在酸性氧化鋁表面裝入索氏提取器中，再用原本對(duì)蛇床子素溶解性并不強(qiáng)、不適合作重結(jié)晶溶劑的乙酸乙酯連續(xù)回流洗脫，突出乙酸乙酯對(duì)吸附在酸性氧化鋁表面的蛇床子素的選擇性洗脫能力，巧妙地將提取裝置用于分離操作，從而實(shí)現(xiàn)只用乙醇與乙酸乙酯兩種低毒又經(jīng)濟(jì)的試劑即可方便快捷地制備高純度蛇床子素，為蛇床子素的工業(yè)化開(kāi)發(fā)提供了安全可行的工藝條件。

1 儀器與材料

LC-15高效液相色譜儀(島津);SPD-15C紫外可見(jiàn)檢測(cè)器(島津);蛇床子素對(duì)照品由國(guó)家藥品生物制品檢定所提供;蛇床子購(gòu)自亳州藥材市場(chǎng)(供試藥材由山東省中醫(yī)藥研究院孫立立研究員鑒定);FL-1大孔吸附樹(shù)脂(天津歐瑞生物科技有限公司);乙醇、乙酸乙酯、氧化鋁均為化學(xué)純。

2 研究方法

2.1 色譜條件

色譜柱:島津 C-18柱(250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈∶水 =70∶30，檢測(cè)波長(zhǎng):249 nm，流速:0.8 mL/min，理論塔板數(shù):5 000，進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱(chēng)取蛇床子素對(duì)照品加乙醇成100 μg/mL溶液作為對(duì)照品溶液，精密量取對(duì)照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL分別注入液相色譜儀，以蛇床子素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，吸收峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=308X+342，R=0.998，表明蛇床子素在0.28～1.10 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 藥材蛇床子中蛇床子素的含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》藥材蛇床子“含量測(cè)定”項(xiàng)下要求操作［8］。

2.4 蛇床子素制備

蛇床子藥材分成不破碎、破粗粉、破細(xì)粉各100 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為75%、85%、95%的乙醇回流提取3次，每次1 h。合并乙醇提取液于68℃減壓蒸餾回收乙醇，轉(zhuǎn)水液放置至室溫，濕法上樣1 kg FL-1大孔樹(shù)脂層析柱(柱直徑8 cm、柱床高度80 cm)。上樣后用水洗脫2個(gè)柱床、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫2個(gè)柱床，體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗脫至洗脫液檢不出蛇床子素，減壓蒸餾回收體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇洗脫液至無(wú)乙醇蒸餾液滴出。

取上述蒸除乙醇的蛇床子素水溶液分別拌入中性、酸性、堿性氧化鋁50 g，80℃烘干水分粉碎過(guò)60目篩，裝入濾紙筒置索氏提取器中加乙酸乙酯500 mL浸泡過(guò)夜，連續(xù)回流洗脫10 h，洗脫液蒸餾回收溶劑至過(guò)飽和狀態(tài)，放置析出白色蛇床子素結(jié)晶，經(jīng)HPLC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)在95%以上。

蛇床子素得率(%)=(制得蛇床子素總量/藥材蛇床子素量)×100%。

制得蛇床子素總量=(產(chǎn)品中蛇床子素測(cè)得量/測(cè)定稱(chēng)樣量)×制得物總量。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝

采用L9(34)正交表考察乙醇濃度、藥材粉碎度、氧化鋁酸堿性對(duì)蛇床子素得率的影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal experiment design

3 結(jié)果與討論

3.1 供試蛇床子藥材中蛇床子素含量測(cè)定結(jié)果

3份平行樣品測(cè)定結(jié)果(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為1.21%、1.24%、1.25%，平均含量1.23%，符合《中國(guó)藥典》“含量不低于1%”的要求。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1的設(shè)計(jì)測(cè)定不同影響因素(A、B、C)以及不同水平對(duì)應(yīng)的純化產(chǎn)品中蛇床子素含量，計(jì)算蛇床子素得率(表2)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2分析知，上述因子影響蛇床子素得率的程度依次為:A＞B＞C，乙醇濃度對(duì)蛇床子素提取得率影響最大，最佳工藝組合為A3B2C1，即加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇于粉碎成粗粉的蛇床子中回流提取，提取液回收溶劑轉(zhuǎn)水液上大孔樹(shù)脂柱，大孔柱體積分?jǐn)?shù)80%乙醇洗脫液回收溶劑后拌酸性氧化鋁烘干后，再用乙酸乙酯回流洗脫，乙酸乙酯洗脫液回收溶劑至過(guò)飽和狀態(tài)放置析晶，此工藝蛇床子素得率最高。

乙酸乙酯在連續(xù)回流條件下可以選擇性地洗脫吸附在酸性氧化鋁表面的蛇床子素，洗脫液回收溶劑至過(guò)飽和狀態(tài)后便可析出高純度蛇床子素，相比重結(jié)晶法可以大大減少有機(jī)溶劑用量，提高工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程的安全性、降低生產(chǎn)成本;而與色譜法分離蛇床子素工藝比較，本文方法可以減少操作環(huán)節(jié)、增加樣品處理量和產(chǎn)品中蛇床子素的均一性。

蛇床子素在氧化鋁表面的吸附性能與洗脫性能目前未見(jiàn)報(bào)道，所以相關(guān)基礎(chǔ)研究薄弱，氧化鋁的粒度、晶型、含水量對(duì)蛇床子素吸附與洗脫的影響、結(jié)晶母液中的蛇床子素的回收利用等都是下一步研究的重點(diǎn)。

［1］閆俊，宣衛(wèi)東，卞俊.蛇床子素研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2012，21(11):110-112.

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［6］王徐強(qiáng)，管文佳.一種蛇床子素的制備方法:中國(guó)，CN201010531931.6［P］.2011-02-16.

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