一種基于水解過程的多糖快速鑒別方法

馬耀宏，孟慶軍，楊艷，楊俊慧，史建國，張利群，鄭嵐，劉偉霞

(1.山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南250014;2.山東農業大學，山東泰安271018;3.山東省計算中心，山東濟南250014)

糖類是生物體內除蛋白質和核酸以外的又一類重要的物質，蘊涵十分豐富的生物學信息，是細胞識別和信息遺傳等重要生物學功能的參與者，近年來已成為生命科學研究的熱點［1－2］。

多糖，尤其是水溶性多糖，由于在免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面具有獨特的生理活性與功能［3－4］，相關研究進展迅速。隨著該研究領域儀器分析手段的不斷進步，有關多糖結構與功能關系的研究備受關注［5－6］。目前對多糖結構功能研究常用的大型儀器分析技術有氣質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振、高效液相、X射線晶體掃描以及原子力顯微技術等［7－8］。但是，由于多糖結構特點的復雜性，使得單一儀器分析手段具有一定的局限性。氣相色譜法測定糖類所遇到的主要困難是糖類本身沒有足夠的揮發性，必須將其轉化為揮發性衍生物才能進行測定。高效液相色譜法由于使用通用的示差折光檢測器靈敏度低而受到限制;若使用紫外或熒光檢測器來提高分析靈敏度，糖類化合物須先經過標記衍生，操作繁雜;并且衍生反應的發生總伴隨樣品的損失，這對目前分析要求的日益提高不利。傳統的電泳法及20世紀80年代后期迅速發展起來的高效毛細管電泳法能進行糖的分離檢測，但重復性相對較差，該技術的穩定性能達不到實際需求。核磁共振技術解決了糖苷鍵構型問題，但難以分辨非異頭質子的位移，解析方法十分繁雜。通常要弄清楚一個多糖的結構往往需要數種大型儀器與化學分析方法結合，同時花費專業研究人員幾個月甚至整年的時間與精力。這些實驗方法由于測試周期長，根本無法在生產過程中使用。多糖的快速分析與鑒別是多糖研究領域的熱點問題。本文研究了水溶性多糖水解過程中還原糖(還原性末端數)和葡萄糖的水解過程變化規律，通過分析水解過程圖譜，實現了對樹舌、靈芝和蟲草多糖的快速鑒別，目前國內外未見相關研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

HH-S型恒溫水浴鍋，上海羌強儀器設備有限公司;JPI-5型架盤天平，蘇州博泰偉業電子科技有限公司;YH-1型電子萬用爐，金壇市諾藝實驗儀器廠;SBA-40D型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;SGD-IV-D型全自動還原糖測定儀，山東省科學院生物中心;81-2型磁力恒溫攪拌器，上海思樂自動化科技有限公司;DS-1型高速組織搗碎機，上海滿賢經貿有限公司;20RP-52D型自動高速冷凍離心機，內蒙古農大動物科學與醫學學院;A-2電熱鼓風干燥箱，福建省泉州宇博電子廠。

1.1.2 試劑

0.15 mol/L鹽酸的配制:用移液管取37% 濃鹽酸6.25 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL。

0.10 mol/L氫氧化鈉溶液的配制:稱量氫氧化鈉4.0 g，加入到盛有適量蒸餾水的燒杯中，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.00 g/L葡萄糖標準溶液的配置:精密稱量烘干后的無水葡萄糖1.000 0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法［9－10］

1.2.1 胞外粗多糖的制備

分別取培養成熟的樹舌、靈芝和蟲草發酵液，以發酵液中殘留還原糖低于0.01%為基準，用5 000 r/min離心機離心15 min，并用0.2 μm過濾器過濾，獲得上清液。上清液加入1.5～3倍無水乙醇沉淀多糖30 min。醇沉液體用10 000 r/min，離心15 min，棄上清液。沉淀置于60℃電熱鼓風干燥箱中烘干24 h，獲得胞外粗多糖樣品。

1.2.2 胞內多糖的制備

蟲草發酵液經離心后的菌絲體沉淀，用蒸餾水沖洗3～4次，菌絲體中加入適量5% 氯化鈉溶液，放入組織搗碎機中，高速搗碎30 min。搗碎的菌絲體液，用超聲波進行細胞破碎。破碎菌絲體溶液100℃煮沸2 h。溶液冷卻后，用高速離心機10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1.5倍體積的無水乙醇，靜置過夜，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，于60℃烘箱中烘干，即得蟲草胞內粗多糖樣品。

1.2.3 多糖的酸水解方法

精密稱取0.300 0 g多糖樣品，于100 mL小三角瓶中，加入30.0 mL蒸餾水充分溶解，再加入30.0 mL 0.15 mol/L鹽酸，混勻，沸水浴5 h。水解前半個小時每隔5 min，以后每隔10 min取0.50 mL的水解液，將水解液迅速冷卻并加入0.30 mL濃度為0.10 mol/L的氫氧化鈉溶液終止水解反應，后微調水解液pH值至7.0，獲得該樣品的不同水解時間的水解液測試樣品。

1.2.4 水解過程參數的測定方法

還原糖含量使用SGD-IV-D型全自動還原糖測定儀測定，每次取樣量0.5 mL;葡萄糖含量采用SBA-40D型葡萄糖酶電極法，每次取樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 樹舌多糖水解過程圖譜

平行測定兩次樹舌多糖水解過程中葡萄糖、還原糖的含量變化。稱取樹舌粗多糖0.299 8 g，按1.2.3和1.2.4的測定方法，測定結果見圖1;平行測定稱取樹舌粗多糖0.300 3 g，按同樣方法測定，結果見圖2。

圖1 樹舌多糖水解過程圖譜Fig.1 Hydrolysis process map of Ganoderma applanatum Pat polysaccharides

圖2 平行測定樹舌多糖水解過程圖譜Fig.2 Paralleldetermination hydrolysis processmap of Ganoderma applanatum Pat polysaccharides

由圖1圖譜可知，多糖水解過程中葡萄糖和還原糖含量隨時間逐步增加。葡萄糖含量在糖水解過程中占還原性糖的比例由起始時的75%左右逐漸降低至65%左右;由圖2圖譜可見同樣的結果。圖1～2顯示葡萄糖和還原糖在時間進程上數值穩定，葡萄糖占還原糖比值穩定。由圖1和圖2比對可以看出，同一種樹舌多糖樣品水解圖譜是穩定的，圖形相似。

2.2 靈芝多糖水解過程圖譜

平行測定兩次靈芝多糖水解過程中葡萄糖、還原糖的含量變化。稱取靈芝粗多糖0.300 3 g，按1.2.3和1.2.4的測定方法，結果見圖3;平行測定稱取靈芝粗多糖0.300 2 g，按同樣的測定方法，結果見圖4。

由圖3可知，靈芝多糖水解過程中葡萄糖和還原糖含量隨時間逐步增加。葡萄糖含量在靈芝多糖水解過程中占還原性糖的比例由啟始時的70%左右逐漸提高為80%左右;由圖4可見同樣的結果。圖3～4顯示葡萄糖和還原糖在時間進程上數值穩定，葡萄糖占還原糖比值穩定。

由圖3～4可知，水解5 h后，該靈芝粗多糖水解液中葡萄糖占還原糖的比例分別為80%、78%。圖3和圖4的比對分析顯示，同一種靈芝多糖樣品水解圖譜是穩定的。

2.3 蟲草胞內多糖水解過程圖譜

稱取蟲草胞內粗多糖0.300 3 g，按1.2.3和1.2.4水解過程參數的測定方法，結果見圖5，平行測定稱取蟲草胞內粗多糖0.300 5 g，按同樣的方法測定，結果見圖6。

由圖5～6可知，蟲草胞內多糖在該水解條件下水解液中幾乎不含葡萄糖，多糖水解過程中還原糖含量隨時間逐步增加。圖譜1～2顯示葡萄糖和還原糖在時間進程上數值穩定，還原糖水解速率幾乎相同。還可以看出，同一種蟲草胞內多糖樣品水解圖譜是穩定的。

圖3 靈芝多糖水解過程圖譜Fig.3 Hydrolysis process map ofGanoderma lucidum polysaccharides

圖4 平行測定靈芝多糖水解過程圖譜Fig.4 Paralleldetermination hydrolysis processmap of Ganoderma lucidum polysaccharides

圖5 蟲草胞內多糖水解過程圖譜Fig.5 Hydrolysis process map of Cordyceps polysaccharides

圖6 平行測定蟲草胞內多糖水解過程圖譜Fig.6 Paralleldetermination hydrolysis processmap of Cordyceps polysaccharides

3 結論

(1)在精密控制多糖水解的條件下，同一種樹舌、靈芝和蟲草胞內多糖的水解圖譜是穩定且可以重復的。

(2)通過比較樹舌、靈芝和蟲草胞內多糖的水解圖譜，發現它們之間的區別非常明顯。每一種多糖的水解圖譜具有各自的特征，同種多糖水解過程參數測定數值穩定，且參數之間對應關系穩定。比對不同多糖水解過程中葡萄糖、還原糖含量的水解圖譜，可以實現對不同來源的多糖的快速鑒別分析。

(3)如果建立更多的單糖快速分析傳感器，如半乳糖、木糖以及甘露糖等，用來記錄標準水解條件的多糖的水解過程，建立多糖水解過程圖譜庫，開發比對分析軟件，就能夠根據水解過程圖譜來實現對多糖的快速分析，同時獲得該多糖的更多信息。如果能夠進一步從水解過程中分辨到相對分子量、糖苷鍵、異構形式和單糖構型等水解信息，就有可能建立基于水解過程的多糖快速分析方法。

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