龍脷葉提取物體外抑菌活性初步研究

黃 燕 譚建寧 馬雯芳

（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530001）

龍脷葉為大戟科植物龍脷葉Sauropus spatuli folius Beille的干燥葉，主要分布在廣西、廣東、福建等地，《廣西本草選編》（第一版）和《廣西藥用植物名錄》均有收載[1-2]。龍脷葉既可食用又可入藥：壯藥記載龍脷葉能通氣道、谷道，潤肺止咳，滑腸通便，因潤肺止咳的功效而用于治療埃病（咳嗽），胸悶，阿意囊（便秘），是臨床上常用壯藥[3]。2010 版《中國藥典》將龍利葉收載其中，其性甘、淡、平; 歸肺、胃經；具有潤肺止咳，通便等功效; 主要用于肺燥咳嗽，咽痛失音，便秘等[4]。華南地區民間常用它煲涼茶以祛痰化濕，也可與瘦豬肉或豬肺同煮，治療肺熱咳嗽、失音、喉痛、急性支氣管炎、上呼吸道炎等癥。有文獻報道[5]，龍利葉的提取液對金黃色葡萄球菌、血液性鏈球菌有明顯的抑制作用，但是對龍脷葉抑菌活性成分的研究工作還不夠系統和深入。本研究通過考察龍脷葉醇提取物對六種常見呼吸道、腸道致病菌的體外抑菌作用，篩選出龍脷葉的抗菌活性部位，為進一步分離活性成分及其綜合開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）材料。龍脷葉2013年4月購于玉林藥材批發市場，經廣西中醫藥研究院嚴克儉助理研究員鑒定，為大戟科植物龍脷葉Sauropus spatuli folius Beille的干燥葉。粉碎成粗粉（過20目篩），待用。

（2）供試菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC 26003）、大腸桿菌（ATCC 44102）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、傷寒沙門氏菌（ATCC 50075）均購自中國食品藥品檢定研究院；金黃色葡萄球菌耐藥株、乙型副傷寒沙門氏菌由廣西中醫藥大學微生物教研室保存并提供。

（3）儀器與試劑。無菌凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；電熱恒溫培養箱（上海醫療器械七廠）；壓力蒸汽滅菌器（上海醫用核子儀器廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠），KQ5200B型超聲提取儀，RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），恒溫水浴鍋（DK-98-∏A）。營養瓊脂（BR），石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 試驗方法

（1）龍脷葉提取物的制備。取龍脷葉粗粉 50g，分別用10 倍量的50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇80℃回流提取兩次，每次2 h，濾過，合并濾液得到龍脷葉不同濃度乙醇的提取液。將以上龍脷葉醇提取液旋轉蒸發并揮干溶劑，得到乙醇浸膏。用20%的二甲基亞砜分別溶解后得到龍脷葉50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物，濃度分別為0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生藥計），滅菌后放冰箱保存備用。另取龍脷葉粗粉50g，加入500ml 蒸餾水，超聲提取1小時，濃縮得到浸膏。用20%的二甲基亞砜溶解，得到龍脷葉水提取物，濃度為0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生藥計），滅菌，備用。

（2）龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位的制備。取龍脷葉粗粉50g，加10 倍量的50%乙醇于80℃回流提取2h，濾過。50%乙醇提取液旋轉蒸發并揮干溶劑，得到浸膏。浸膏以水分散均勻，用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次進行萃取分離。將各萃取層真空濃縮至干，用20%的二甲基亞砜分別溶解后得到得石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相。濃度分別為0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生藥計），滅菌后放冰箱保存備用。

（3）MH培養基的制備。稱取營養瓊脂76g，加蒸餾水1000mL，按常規方法配制，于高壓蒸汽滅菌（0.15 MPa，125℃，30 min）后置于50℃水浴平衡，備用。

（4）供試菌的活化及菌懸液的制備。首先把金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、乙型副傷寒沙門氏菌在MH培養基的斜面上傳3次，使其生長穩定，狀態良好。在制好的平板上劃定區域后用2μL定量接種環進行細菌接種。將供試菌株分別接種于MH平板上，待接種點菌液干后，置 37 ℃ 恒溫培養箱培養24 h，進行活化。挑取活化后的各菌種置于無菌生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏單位的菌液，然后稀釋10倍（約含菌1.5 × 107CFU·mL-1）。稀釋后菌液應在15 min 內接種完畢。

1.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定

（1）龍脷葉提取物最低抑菌濃度的測定。[6]采用連續二倍梯度瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）。分別取10 mL龍脷葉水提取物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物（0.5 g·mL-1），加入10 mL滅菌蒸餾水（0.15MPa，125 ℃，30 min滅菌），在MH培養基中充分混勻，制備厚度為4mm，內徑為90mm的含藥平板，每塊含藥平板含有龍脷葉提取物的濃度分別為250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976、0.488 mg·mL-1（按每毫升所含的生藥計）等10個濃度，冷卻凝固，在含藥平板上劃定區域，每個平皿中加入菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻，平板置 37 ℃ 恒溫培養箱培養24 h后后觀察結果，以無細菌生長的提取物最低濃度為最低抑菌濃度。同時設20%的二甲基亞砜為空白對照。各濃度含藥平板平行制備三份。

（2）龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌濃度的測定。采用連續二倍梯度瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）。取15 mL龍脷葉50%乙醇提取物（0.5 g·mL-1），加入15 mL滅菌蒸餾水（0.15MPa，125 ℃，30 min滅菌），在MH培養基中充分混勻，制備厚度為4mm，內徑為90mm的含藥平板，每塊含藥平板含有龍脷葉提取物的濃度分別為250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976、0.488 mg·mL-1（按每毫升所含的生藥計）等10個濃度，冷卻凝固，在含藥平板上劃定區域，每個平皿中加入菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻,平板置 37 ℃ 恒溫培養箱培養24 h后后觀察結果，以無細菌生長的提取物最低濃度為最低抑菌濃度。同時設鹽酸環丙沙星（5mg·mL-1）的平板為陽性對照，20%的二甲基亞砜為空白對照。各濃度含藥平板平行制備三份。

2 結果與分析

2.1 龍脷葉提取物最低抑菌濃度（MIC）試驗結果

將六種供試菌株，按每系列濃度平行測定三次，重復觀察，所得結果見表 1。從表 1 可知，龍脷葉水提取物和50%乙醇提取物對六種供試菌株均有較好的抑菌作用，兩者比較，以50%乙醇提取物抑菌效果最好，其最小抑菌濃度在31.3～62.5 mg·mL-1之間；龍脷葉50%乙醇提取物對六種供試菌株均有較好的抑菌作用，其最小抑菌濃度在31.3～62.5 mg·mL-1之間；龍脷葉70%乙醇提取物僅對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，其最小抑菌濃度在62.5～125mg·mL-1之間；龍脷葉95%乙醇提取物對六種供試菌株的抑菌作用均不明顯，其最小抑菌濃度在125～250mg·mL-1之間。由此結果，我們選擇抑菌作用較強的50%乙醇提取物做進一步的分部位萃取，測定龍脷葉不同溶劑提取物的最低抑菌濃度（MIC），觀察其不同溶劑提取物的抑菌效果。

表1 龍脷葉不同溶劑提取物最低抑菌濃度（MIC）測定結果（n=3）

2.2 龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌濃度（MIC）試驗結果

對龍脷葉 50%乙醇提物三個萃取部位分別進行最低抑菌濃度（MIC）的測定，結果見表2。從表 2 可知，龍脷葉醇提物石油醚部位對傷寒沙門氏菌的抑菌作用最強，對六種供試菌株的 MIC分別為：對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株和銅綠假單胞菌的MIC為250mg·mL-1，對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的MIC為125 mg·mL-1，對傷寒沙門氏菌的MIC為62.5 mg·mL-1；龍脷葉醇提物乙酸乙酯部位對六種供試菌株的抑菌作用均不明顯，其 MIC分別為：對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株和乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的MIC為250mg·mL-1，對大腸桿菌、銅綠假單胞菌的MIC為125 mg·mL-1；龍脷葉醇提物正丁醇部位對六種供試菌株均有明顯的抑菌作用，其 MIC分別為：對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、大腸桿菌的MIC為15.6 mg·mL-1，對銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的MIC為7.81 mg·mL-1。

表2 龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌濃度（MIC）測定結果（n=3）

3 討論與結論

（1）龍脷葉（Sauropus spatuli folius Beille）常用于治療上呼吸道炎癥引起的咳嗽，咽痛、急性支氣管炎等癥，故本試驗選擇常見的六種呼吸道、腸道致病菌，即革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、金黃色葡萄球菌耐藥株（Methicillin resistant Staphylococcus aureus）和革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）和乙型副傷寒沙門氏菌（Bacillus paratyphosus B）進行體外抑菌作用，結果表明龍脷葉乙醇提取物具有一定的體外抑菌作用。

（2）環丙沙星為合成的第二代喹諾酮類抗菌藥物,具廣譜抗菌活性，殺菌效果好，試驗采用鹽酸環丙沙星作為陽性對照考察抑菌效果，結果龍脷葉醇提物正丁醇部位對六種試驗菌株的MIC在7.81～15.6 mg·mL-1之間，陽性對照鹽酸環丙沙星對六種試驗菌株的MIC均為 1.95 mg·mL-1，MIC相差4-8倍，表明龍脷葉醇提物正丁醇部位的抑菌效果明顯。

（3）本試驗采用連續二倍梯度瓊脂稀釋法測定 MIC，并以MIC的測定結果分別對50%、70%和95%三種濃度的乙醇提取物的抑菌作用進行跟蹤提取，再對抑菌效果明顯的50%的乙醇提取物進行分極性部位的MIC測定，確定抑菌活性部位。

（4）以 20%的二甲基亞砜作為龍脷葉提取物的溶劑，既能增加溶解度，又不會造成干擾，經空白對照試驗對龍脷葉提取物的抑菌作用無影響。

（5）本研究對龍脷葉體外抑菌活性進行了初步研究，下一步的研究工作我們將對其進行活性指導下的活性化合物的進一步分離純化以及結構解析，對單體的抗菌活性及抗菌機制進行深入的研究和探索。

[1] 廣西壯族自治區革命委員會衛生局主編.廣西本草選編[M].第一版.南寧:廣西人民出版社,1974,1259.

[2] 廣西壯族自治區中醫藥研究所編.廣西藥用植物名錄[M].廣西:廣西人民出版社,1986:198.

[3] 廣西壯族自治區食品藥品監督管理局.廣西壯族自治區壯藥質量標準2008年版(第一卷)[M].廣西:廣西科學技術出版社,2008: 77.

[4] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部[S].北京:中國醫藥科技出版社, 2010: 90.

[5] 李秉滔;草藥龍鶪葉原植物的考證[J].華南農學院學報,1981,2(1):41.

[6] 臨床微生物學和微生物檢驗實驗指導[M].北京:人民衛生出版社,2006: 42-43.