阿魏酸預處理對阿霉素誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用

吳枝娟，余 靖，王瑞幸，方秋娟，林默君

(福建醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，福建福州 350108)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是臨床常用的蒽環類廣譜抗腫瘤藥，廣泛用于急性白血病、乳腺癌、胃癌等多種惡性血液系統腫瘤和實體瘤的治療。然而，DOX可造成不可逆的心肌損傷和心力衰竭，且無有效的防治措施，嚴重限制了 DOX的臨床應用［1］。因此，尋找高效低毒且不影響DOX抗腫瘤作用的心臟保護劑，是DOX化療中急待解決的問題。DOX心臟毒性的機制尚未完全明確，現有研究顯示，DOX誘發的氧化應激及心肌細胞凋亡是心肌損傷的主要機制［2］。

阿魏酸(ferulic acid，FA)化學名稱為4-羥-3-甲氧基肉桂酸，是阿魏、當歸、川芎等多種中藥的有效成分。FA具有抗血小板凝集、抗脂質過氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，同時毒性很低［3－4］。近年來，FA的心臟保護作用日益受到關注。大量文獻報道，FA可以減輕缺血/再灌注、鐵過載等引起的心臟損傷。FA具有很強的抗氧化能力，可以清除自由基，減少心肌細胞凋亡［5－7］。但FA對DOX心肌損傷的作用未見相關報道。本文通過研究FA對DOX誘導的H9c2細胞損傷、氧化應激及細胞凋亡的影響，為FA防治DOX心臟毒性提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 H9c2(2-1)大鼠心肌細胞株、SGC-7901人胃癌細胞株、HL-60人早幼粒細胞白血病細胞株、MCF-7人乳腺癌細胞株購自中國科學院細胞庫。注射用鹽酸阿霉素，深圳萬樂藥業有限公司生產，批號:1309E1。阿魏酸標準品(純度＞98%)購自西安森卓生物科技有限公司，批號:SZ20140115。以注射用生理鹽水配成1 mmol·L－1DOX和25 mmol·L－1FA儲備液，－20℃保存，臨用前稀釋至所需濃度。高糖DMEM及RPMI 1640培養液購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司。caspase-3、Bax、Bcl-2抗體購自 Santa Cruz公司。吖啶橙(acridine orange，AO)、溴化乙錠(ethidium bromide，EB)購自 Sigma-Aldrich公司。肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白濃度測定試劑盒、活性氧檢測試劑盒、細胞計數CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 H9c2、SGC-7901、MCF-7細胞培養于含體積分數為0.1胎牛血清的高糖DMEM培養液，HL-60細胞培養于體積分數為0.1胎牛血清的RPMI 1640培養液。37℃、CO2體積分數0.05、飽和濕度條件下培養。細胞貼壁80%時，胰酶消化、計數、傳代，每2～3天傳代1次。取接種24 h對數生長期細胞進行實驗，設Control、DOX和FA 10、FA 20、FA 40 預處理(Pre-treated)及共處理(Co-treated)組。對照組和DOX組分別加入相應溶劑和 1 μmol· L－1DOX 培養 24 h;FA 10、FA 20、FA 40 預處理組加入10、20、40 μmol· L－1FA 預處理2 h后，再加入DOX共培養24 h;共處理組加入10、20、40 μmol· L－1FA 與 DOX 共培養 24 h。

1.2.2 CCK-8法測定細胞生存率 取對數生長期細胞，以2×107·L－1細胞濃度接種96孔板，各實驗組設4個復孔，另設無細胞培養液孔為空白對照。根據CCK-8試劑盒說明書，處理結束后每孔加入10 μl CCK-8工作液。37℃培養2 h，酶標儀(Elx800，BioTek，USA)記錄450 nm波長處的吸光度。取4孔光密度(optical density，OD)的平均值，按下列公式計算細胞存活率:生存率/%=(OD處理組－OD空白組)/(OD對照組－OD空白組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3 培養液 CK、LDH 及細胞裂解液 MDA、SOD測定 取各處理組培養液上清和細胞裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按試劑盒說明書分別測定活性和含量。

1.2.4 DCF-DA熒光檢測細胞內活性氧變化 按照活性氧檢測試劑盒說明書操作。收集細胞，調整細胞濃度至 2 ×109·L－1，加入 10 μmol·L－1DCFDA，37℃孵育20 min，無血清培養液洗去未結合DCF-DA，每個樣品收集1×104個細 胞，流式細胞儀 (FACSVerseflow cytometry， BD Biosciences，USA)檢測熒光強度(激發波長488 nm，發射波長525 nm)，FlowJo 7.6軟件分析數據，計算 DCF-DA標記陽性細胞百分率。

1.2.5 AO-EB染色檢測細胞凋亡 各處理組細胞，AO/EB染液孵育10 min，封片后在熒光顯微鏡(IX70-S8F2，Olympus，Japan)下觀察?？梢?種細胞:活細胞(VN)，核染色質被AO染成綠色并呈正常結構;早期凋亡細胞(VA)，核染色質著綠色并呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細胞(NVA)，膜受損，核染色質被EB染成桔紅色并呈固縮或圓珠狀;壞死細胞(NVN)，膜受損，核染色質被EB染成桔紅色并呈正常結構。鏡下隨機取3個視野，分類計數100個細胞，凋亡率/%=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。

1.2.6 DNA瓊脂糖凝膠電泳 各處理組收集1×106細胞，用 PBS洗兩次，加入50 μl細胞裂解液(200 mmol·L－1Tris-HCl pH=7.5，1 g·L－1NP-40，20 mmol·L－1EDTA)和終濃度0.5 g·L－1蛋白酶K，50℃溫育4 h。不含DNA酶的200 mg·L－1RNaseA，37 ℃消化2 h。離心去沉淀，取15 μl樣品與2.5 μl上樣緩沖液混和，上樣于1.5%0.5 ×TBE的瓊脂糖凝膠(含0.5 mg·L－1EB)樣品槽上。100 V電泳30 min，凝膠成像系統(GelDoc 2000，Bio-Rad，USA)成像。

1.2.7 Western blot測定 caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白

收集H9c2細胞，預冷的PBS洗滌3次，RIPA全細胞裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法進行蛋白定量。等量總蛋白SDS-PAGE分離后，轉印至 PVDF膜。50 g·L－1脫脂奶粉封閉 1 h，caspase-3、Bax、Bcl-2一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色。Image Quant LAS 4000 mini系統成像，Quantity One軟件灰度分析。

2 結果

2.1 FA預處理提高 H9c2細胞生存率 運用CCK-8法測定細胞生存率。如Fig 1A所示:DOX可劑量依賴性地降低 H9c2 細胞生存，0.5、1、2 μmol·L－1DOX處理24 h細胞生存率分別為(92.37±3.73)%、(78.16±1.68)%、(71.06±2.69)%。根據以上結果并參考相關文獻報道［8］，以 1 μmol·L－1DOX處理24 h建立H9c2細胞損傷模型。

以前期預實驗為基礎，參考FA臨床常用劑量的血藥濃度范圍，選取 10、20、40 μmol·L－13 個劑量濃度的FA處理DOX損傷的H9c2細胞，觀察FA對DOX心肌損傷的作用。結果顯示:10、20、40 μmol·L－1FA單用不影響H9c2細胞生存率(P＞0.05)(Fig 1B)。FA預處理和共處理均使細胞生存率有不同程度提高。FA預處理組細胞生存率均高于相同劑量FA共處理組，其中低、中劑量組差別有顯著性(P＜0.05，Pre-treatedvsCo-treated)。20、40 μmol·L－1FA預處理組細胞生存率為(96.95±6.33)%和(99.24±4.98)%，較DOX損傷組明顯升高(P＜0.05)，且接近正常水平(P＞0.05vsControl)。以上結果說明:FA預處理的保護作用優于共處理，值得進一步研究。

Fig 1Effect of FA on cell viability of H9c2 cells(±s，n=3)

2.2 FA預處理減輕H9c2細胞損傷

2.2.1 FA逆轉DOX誘導H9c2細胞形態學變化如Fig 2所示，倒置相差顯微鏡觀察發現:正常H9c2細胞呈梭形，排列規整，大小均一，胞核、胞質境界清楚。DOX損傷組細胞大小不規則，胞體變圓、皺縮，胞核增大，胞質有空泡出現。FA預處理組細胞大小較為均一，形態趨向正常，細胞皺縮變形和胞質空泡化減少。

Fig 2 Effect of FA on morphology of H9c2 cells injured by DOX(×200)

2.2.2 FA減少H9c2細胞培養液LDH、CK釋放量

與對照組比較，DOX損傷組細胞培養液中LDH和CK的含量升高了65.43%和95.77%(P＜0.01)。FA預處理組細胞培養液LDH和CK的含量有所降低，高劑量FA預處理組LDH和CK含量較DOX損傷組降低了23.57%和31.42%，差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of FA on LDH and CK levels in cultured fluid of DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

Tab 1 Effect of FA on LDH and CK levels in cultured fluid of DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05 vs DOX.

Group LDH/U·L－1 CK/U·L －1 Control 25.83 ±3.21 2.13 ±0.18 DOX 42.73 ±7.47## 4.17 ±0.62##FA 10 μmol·L －1 40.27 ±6.49# 3.77 ±0.47##FA 20 μmol·L －1 38.36 ±6.45# 3.12 ±0.31#*FA 40 μmol·L －1 32.66 ±5.21#* 2.86 ±0.25#*

2.3 FA預處理抑制DOX誘導的氧化應激

2.3.1 FA減少活性氧生成 DCF-DA熒光染色，流式細胞術比較各處理組細胞活性氧(reactive oxy-gen species，ROS)含量。結果如 Fig 3 所示，1 μmol·L－1DOX處理24 h使DCF-DA陽性率由(30.29±2.87)%升高至(47.51±2.41)%。FA預處理可對抗 DOX 誘導的 ROS 增多。10、20、40 μmol·L－1FA處理組DCF-DA陽性率降低至(39.77±2.69)%、(38.19±3.02)%和(34.59±2.62)%(P＜0.05vsDOX損傷組)。

Fig 3 FA inhibits ROS generation induced by DOX in H9c2 cells(±s，n=3)

2.3.2 FA降低DOX損傷H9c2細胞MDA水平，增加SOD活性 DOX損傷組細胞內MDA水平升高，而SOD活性降低(P＜0.05)。與DOX損傷組比較，低、中、高劑量FA預處理組MDA含量分別降低6.77%、26.99%和33.92%(P＜0.05);中、高劑量FA處理組SOD活性升高24.94%和21.32%(P＜0.05)。

2.4 FA預處理抑制DOX誘導的H9c2細胞凋亡

2.4.1 FA減少心肌細胞凋亡 AO-EB熒光染色檢測心肌細胞凋亡。結果如Fig 4所示:對照組細胞凋亡率僅為(2.43±0.52)%;DOX損傷組凋亡率明顯升高，達(21.81±3.17)%(P＜0.01);低、中、高劑量FA預處理組，細胞凋亡率逐漸降低。中、高劑量FA預處理組細胞凋亡率較DOX損傷組降低45.76%和53.65%(P＜0.05)。

Fig 4 Effect of FA on apoptosis induced by DOX in H9c2 cells(±s，n=3)

2.4.2 FA減輕DNA片段化 細胞凋亡的主要生化特征是DNA片段化。DNA瓊脂糖凝膠電泳結果如Fig 5所示:DOX損傷組呈現凋亡特征性梯狀圖譜(DNA ladder)。FA預處理減輕DOX誘導的DNA片段化。10 μmol·L－1FA處理組仍可見較為清晰的 DNA ladder，20 和 40 μmol·L－1FA 處理組未檢到典型的DNA ladder。

Tab 2 Effect of FA on MDA and SOD in DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effect of FA on MDA and SOD in DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DOX.

Group MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro Control 33.64 ±5.93 47.38 ±3.52 DOX 64.29 ±6.82## 31.83 ±4.38#FA 10 59.94 ±3.37##* 30.28 ±2.15#FA 20 46.94 ±7.52#* 39.73 ±3.26#*FA 40 42.48 ±4.97#＊＊ 38.58 ±2.97#*

Fig 5 Agarose gel electrophoresis analysis of apoptotic DNA fragments

2.4.3 FA 抑制促凋亡蛋白 caspase-3、Bax，增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表達 蛋白免疫印跡結果如Fig 6所示:1 μmol·L－1DOX 處理 24 h，促凋亡蛋白caspase-3和 Bax含量分別增加61.88%和150.91%;抑凋亡蛋白Bcl-2含量則減少63.04%(P＜0.01)。FA預處理可以抑制上述改變。與DOX損傷組比較，中劑量FA預處理使caspase-3和Bax減少21.19%和49.51%，Bcl-2增加67.36%(P＜0.05vsDOX);高劑量FA預處理caspase-3和Bax減少34.75%和63.52%，Bcl-2增加137.20%(P＜0.01vsDOX)。

2.5 FA預處理不影響DOX對HL-60、SGC-7901、MCF-7細胞的細胞毒作用 有文獻報道，FA具有抗腫瘤作用［9］，但在本研究的心肌保護劑量范圍內，FA預處理是否影響DOX抗腫瘤作用還需要實驗證實。本研究選用3種對DOX敏感的人腫瘤細胞株(人早幼粒細胞白血病HL-60細胞株、人胃癌SGC-7901細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞株)觀察FA對DOX抗腫瘤作用的影響。如Fig 7所示，10、20、40 μmol·L－1FA 預處理后，與 1 μmol·L－1DOX共培養24 h，細胞生存率與DOX單用組比較差異無顯著性(P＞0.05)。40 μmol·L－1FA 預處理，測定 DOX對3種腫瘤細胞的半數抑制濃度(IC50)，結果如Tab 3所示:經FA預處理，DOX對3種腫瘤細胞的IC50無明顯改變(P＞0.05)。

Fig 6 Effects of FA on expression of caspase-3，Bax and Bcl-2 induced by DOX in H9c2 cells(±s，n=3)

Fig 7 Effect of FA on viability of DOX-teated HL-60，SGC-7901，MCF-7 cells(±s，n=3)

3 討論

心臟毒性是DOX最常見和最嚴重副作用，其機制尚未完全明確。氧化應激是DOX心臟毒性的主要原因。DOX在心肌細胞代謝過程中，產生大量活性氧，消耗內源性抗氧化物質，造成心肌細胞膜系統的脂質過氧化，引發一系列的生化及病理變化，導致心肌損傷［10］。心肌細胞凋亡是DOX心臟毒性的另一重要機制。DOX激活細胞凋亡通路，引起心肌細胞凋亡。研究發現:凋亡造成心肌細胞丟失，與DOX心臟毒性的心肌收縮功能障礙和心功能衰竭關系密切［11］。

Tab 3 Effect of FA on DOX's antineoplastic activity against human tumor cell lines(±s，n=3)

Tab 3 Effect of FA on DOX's antineoplastic activity against human tumor cell lines(±s，n=3)

Cells were pre-treated with 40 μmol·L －1FA for 2 h prior to DOX exposure

Cell line IC50of DOX/μmol·L －1 DOX FA+DOX HL-60 0.28 ±0.08 0.31 ±0.12 SGC-7901 7.24 ±0.66 6.93 ±0.44 MCF-7 5.87 ±0.82 6.14 ±0.59

本研究利用DOX誘導的H9c2大鼠心肌細胞損傷模型，評估FA對DOX心肌損傷的保護作用。DOX使H9c2細胞生存率降低、形態改變、心肌酶外漏，引起嚴重的心肌損傷。FA預處理則可提高細胞生存率，使細胞形態趨向正常，LDH和CK外漏減少。CK是特異性心肌標志物，LDH是細胞質中穩定存在的酶類。心肌細胞受損時，CK和LDH釋放入培養液，其漏出量反映細胞膜損傷程度。FA預處理減少了DOX誘導的心肌細胞CK、LDH漏出，說明心肌細胞膜損傷有所減輕。此外，經FA預處理DOX對人早幼粒細胞白血病HL-60細胞株、人胃癌SGC-7901細胞株、人乳腺癌MCF-7細胞株的半數抑制濃度(IC50)無明顯改變，說明在上述心肌保護劑量范圍內FA不影響DOX的抗腫瘤作用。FA預處理可以減輕DOX誘導的H9c2心肌細胞損傷，同時又不影響DOX的抗腫瘤活性，有可能應用于DOX化療的心肌保護，其心肌保護的機制值得深入研究。

FA是天然抗氧化劑，其分子結構中酚醛核及不飽和側鏈可以很容易地形成共軛穩定的苯氧自由基，因此具有很強的清除活性氧的能力［12］。DOX損傷組細胞DCF-DA熒光強度和MDA水平升高。DCF-DA是活性氧的指示劑，MDA是生物體脂質氧化的天然產物。細胞氧化應激時，脂質過氧化產生大量的MDA。FA預處理使DCF-DA熒光強度和MDA水平降低，說明FA可以清除活性氧，減輕脂質過氧化，對抗DOX引起的氧化應激，減輕細胞損傷。心肌細胞內源性抗氧化酶是維持心肌細胞的氧化與抗氧化平衡的重要因素。由于心肌細胞內源性抗氧化酶含量較少，發生氧化應激時難以及時清除活性氧，造成氧化和抗氧化失平衡，使心肌細胞易受到氧化應激損傷［13］。DOX不僅誘導了活性氧生成和脂質過氧化，還能抑制心肌細胞抗氧化酶活性，破壞心肌細胞正常的氧化 －抗氧化平衡，導致細胞損傷［14］。超氧化物歧化酶(SOD)是心肌細胞的主要抗氧化酶。本實驗中，DOX損傷組SOD活性明顯降低，心肌細胞抗氧化能力減弱。FA預處理使SOD活性增高，心肌抗氧化能力增強，則有助于恢復心肌細胞氧化－抗氧化平衡。

本實驗中，AO-EB染色和DNA瓊脂糖凝膠電泳均證明DOX引起H9c2心肌細胞凋亡。FA預處理減少DOX誘導的心肌細胞凋亡，表現為凋亡特征性的DNA片段化減輕，細胞凋亡率呈劑量依賴性降低。蛋白免疫印跡顯示，DOX損傷H9c2細胞凋亡誘導蛋白caspase-3和Bax表達增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達減少，上述結果與文獻報道一致［15－16］。Bax是 Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，細胞受到損傷時，Bax從胞質轉位到線粒體表面，增加線粒體通透性，導致細胞色素C外漏，激活線粒體細胞凋亡途徑。Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，阻止Bax向線粒體移位，拮抗 Bax的促凋亡作用。caspase-3是細胞凋亡的執行者。凋亡早期caspase-3活化(active casapse-3)，裂解相應胞質胞核底物，切割核小體間的DNA，引起細胞凋亡。FA可調節上述凋亡相關蛋白的表達。FA預處理降低DOX損傷心肌細胞促凋亡蛋白Bax和caspase-3含量，同時增加Bcl-2的表達，抑制DOX的促凋亡作用。

綜上所述，本研究首次發現 FA提高DOX損傷H9c2大鼠心肌細胞的生存率，減輕心肌損傷，具有一定的心肌保護作用。FA可清除DOX產生的活性氧，增加心肌SOD酶活性，降低細胞MDA含量，減輕細胞氧化應激損傷。FA抑制促凋亡蛋白caspase-3、Bax，增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，減少DOX誘導的心肌細胞凋亡。FA對DOX心肌損傷的保護作用可能與抗氧化應激和抗心肌細胞凋亡有關。

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