miR－181a對乳腺癌耐藥蛋白表達調控作用的研究

林 姝，焦旭陽，趙 琳，魏敏杰

(中國醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，遼寧沈陽 110001)

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，嚴重威脅患者生命和生活質量。化療在乳腺癌的綜合治療中起著不可替代的作用，但治療中出現(xiàn)的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)嚴重影響了臨床療效及患者預后。在 MDR形成的過程中，P-gp、MRP、BCRP和LRP作為轉運蛋白在腫瘤MDR產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用［1］。乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein，BCRP)作為一種重要的轉運蛋白，是從耐藥的人乳腺癌細胞株MCF7/Adr中用RNA指紋分析法分離出的一種轉運蛋白，包含有2.4kb mRNA翻譯的655個氨基酸殘基，含有1個ATP結合域和1個疏水性跨膜結構域，其基因定位于人染色體4q22［2］。BCRP能夠通過水解ATP供能將轉運底物(化療藥物)從細胞內逆濃度梯度泵到細胞外，特異性使乳腺癌細胞內MX(米托蒽醌)、topotecan(拓撲替康)等濃度下降，從而導致細胞對藥物抵抗，誘導耐藥性產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，BCRP在乳腺癌MDR 中發(fā)揮重要作用，在 MX、topotecan［3］等乳腺癌耐藥細胞中均發(fā)現(xiàn)BCRP過表達;上調乳腺癌細胞中BCRP表達可誘導細胞對tamoxifen(他莫昔芬)、BMS-554417(IGF-1R inhibitor)等藥物的耐藥性［4］。乳腺癌患者BCRP mRNA水平與患者對于蒽環(huán)類抗生素治療的反應性相關，而且，BCRP是乳腺癌干細胞的分子標記物之一［5］。因此，研究BCRP表達的靶向調控機制對于影響乳腺癌MDR具有很重要的意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是長度約22nt的內源性短鏈RNA，通過與目標mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域(3'UTR)特異結合后，通過轉錄后調控的方式抑制目的基因的翻譯和表達。由于BCRP mRNA-3'UTR長度約為2kb，遠長于人類mRNAs-3'UTR 的平均長度700bp［6］，提示 BCRP mRNA-3'UTR可能存在miRNA調控BCRP表達的作用靶點。

本研究通過RNAhybrid和 miRBase Targets分析，發(fā)現(xiàn)miR-181a的“種子區(qū)”，即5'端2～8或1～7核苷酸區(qū)與BCRP的3'UTR序列有配對，表明miR-181a可能與乳腺癌耐藥細胞BCRP表達負相關。因此，本研究選擇miR-181a作為研究對象，檢測乳腺癌耐藥細胞MCF-7/MX和敏感細胞MCF-7中miR-181a的表達水平差異;通過熒光素酶報告基因分析檢測miR-181a與BCRP-3'UTR的結合作用;在乳腺癌耐藥細胞MCF-7/MX中誘導miR-181a高表達，檢測BCRP表達;最后，在乳腺癌敏感細胞MCF-7中抑制miR-181a表達，反向驗證miR-181a對BCRP表達的影響。通過以上研究，擬探討miR-181a對乳腺癌細胞BCRP的調控作用及機制，為發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥性形成與逆轉的新切入點提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 人類乳腺癌細胞MCF-7購自美國經(jīng)典細胞庫(ATCC)，由本實驗室自行凍存。MCF-7/MX是對米托蒽醌(MX)耐藥的乳腺癌細胞，由本實驗室誘導。

1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)ver 3.0試劑盒購自寶生物工程有限公司;TRIzol和LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司。鼠抗人BCRP、MRP、LRP、P-gp等單克隆抗體購自美國Abcom公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG二抗購自北京中衫金橋生物公司;PVDF膜購自寶信生物公司。miR-181a mimic、NC mimic、miR-181a inhibitor、NC inhibitor、miR-181a agmir、NC agmir等購于廣州銳博生物制劑有限公司。膜蛋白提取試劑盒購自于Thermo公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染 MCF-7、MCF-7/MX細胞用含抗生素質量分數(shù)10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。轉染前1天，胰酶消化MCF-7及MCF-7/MX細胞，接種在6孔板(3×105個/孔)或10 cm培養(yǎng)皿(2×106個)中培養(yǎng)，24 h后，用不含抗生素的無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)1 h，之后按LipofectamineTM2000轉染試劑盒操作步驟分別轉染miR-181a mimic，及其非特異性的陰性對照質粒NC mimic或miR-181a inhibitor及其陰性對照質粒NC inhibitor，終濃度為20 nmol·L－1。4 h后，用新鮮的含有體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，備用。

1.4 Luciferase熒光素酶報告分析 應用Luciferase熒光素酶報告分析，對 miRNA-181a是否與BCRP mRNA-3'UTR有結合位點進行檢測。首先，采用PCR擴增BCRP mRNA-3'UTR序列片段以及miRNA-181a序列片段，插入 Luc表達載體 pGL3(Promega)，構建pEGFP-BCRP 3'UTR與pcDNA3.3-miR-181a重組質粒。應用 Lipofectamine 2000將pEGFP-BCRP 3'UTR與pcDNA3.3-miR-181a或pcDNA3.3空質粒(陰性對照)共轉染入293T細胞48 h后，熒光檢測儀檢測熒光強度。

1.5 qRT-PCR 檢測 P-gp、MRP、LRP 和 BCRP 的相對表達水平以及miR-181a的表達水平 MCF-7/MX及 MCF-7細胞分別轉染 miR-181a mimic或miR-181a inhibitor后，按照RNA提取試劑盒步驟，提取 RNA，按 10 μl體系(DEPC H2O 0.45 μl，5 ×

buffer 2 μl，RRI 0.25 μl，M-MLV 0.3 μl，RT-primmer 1 μl，dNTP 1 μl，RNA 5 μl)，反應條件為:30℃，10 min;42℃，1 h，85℃，5 min;5℃，5 min;4℃，2 h，逆轉錄得 cDNA。再按 25 μl體系(去離子水 9 μl，2 ×SYBR Green 12.5 μl，Rox 0.5 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物 0.5 μl，cDNA 2 μl)進行 qRT-PCR 實驗，反應條件為:95℃，2 min(預變性);95℃，15 s;60℃，30 s，40 循環(huán);95℃，1 min;55℃，30 s;95℃，30 s。實驗最少重復3次，對miRNA-181a細胞內表達量以及幾種耐藥蛋白的mRNA進行統(tǒng)計分析。

1.6 Western blot檢測 BCRP、P-gp、LRP、MRP蛋白的表達 MCF-7和MCF-7/MX細胞培養(yǎng)24 h后，將細胞用預冷的PBS洗1遍，按照膜蛋白提取試劑盒(Thermo，89826)操作，用BCA法(碧云天，P0012)進行蛋白定量。取等量蛋白樣品(25 μg)，加5×上樣緩沖液(20%甘油，4%十二烷基硫酸鈉，10%β-巰基乙醇，0.05% 溴酚藍，1.25 mol·L－1Tris-HCl，pH 6.8)，金屬浴 95℃ 變性 10 min 后，用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到PVDF膜上，用含有質量分數(shù)5%脫脂奶粉、體積分數(shù)1%吐溫20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)封閉2 h，TBST沖洗3次，每次10 min，添加5種蛋白抗體:ABCG2/BCRP(Abcam，ab3380)、P-gp(Abcam，ab3366)、LRP(Santa Cruz，sc23916)、MRP(Abcam，ab24102)、βactin(Santa Cruz，sc47778)，稀釋500 倍，室溫孵育2 h，4℃過夜，TBST沖洗3次，每次10 min，添加二抗(中杉金橋，ZB2305)，1∶3 000稀釋，室溫孵育1.5 h，TBST沖洗3次，ECL發(fā)光。實驗最少重復3次，測定灰度值，進行統(tǒng)計學分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 所得結果數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學分析軟件SSPSS 16.0分析處理，數(shù)值用±s表示，實驗最少重復3次，并用單因素方差分析方法(ANOVA)統(tǒng)計比較組間差異，之后用LSD事后檢驗。

2 實驗結果

2.1 qRT-PCR檢測 MCF-7細胞及 MCF-7/MX細胞中miR-181a表達水平 通過qRT-PCR檢測MCF-7細胞及MCF-7/MX兩種細胞中miR-181a表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，與MCF-7細胞(BCRP低表達)相比，MCF-7/MX(BCRP高表達)細胞中miR-181a表達明顯降低(Fig 1，P＜0.05)，表明 miR-181a的高表達與BCRP的低表達相關，提示miR-181a可能是負性調控BCRP表達的重要miRNA。

Fig 1 miR-181a expression in MCF-7 and MCF-7/MX cells(detected by qRT-PCR)*P＜0.05 vs MCF-7

2.2 生物信息學分析miR-181a靶向結合BCRP mRNA-3'UTR區(qū) 為了驗證miR-181a對BCRP表達的負性調控是否與miR-181a和BCRP mRNA-3'UTR的結合作用相關，我們首先應用miRBase Targets Database(www.microrna.sanger.ac.uk)理論預測，發(fā)現(xiàn)包括miR-181a在內的15個microRNAs可與BCRP mRNA-3'UTR結合。進一步通過Targetscan發(fā)現(xiàn)BCRP mRNA-3'UTR存在miR-181a的結合位點，其中①3003bp-3025bp和②3651bp-3673bp是關鍵結合位點(Fig 2)。

Fig 2 Binding sites of miR-181a were predicted by Targetscan in BCRP mRNA-3'UTR

2.3 熒光素酶報告基因分析miR-181a靶向作用于BCRP mRNA-3'UTR區(qū) 進一步通過構建BCRP 3'UTR熒光素酶報告基因質粒，共轉染miR-181a與BCRP 3'UTR至293T細胞中，進行熒光素酶報告基因分析，結果發(fā)現(xiàn):與陰性轉染組(NC mimic與PGL3-BCRP 3'UTR共轉染組)相比，miR-181a mimic與PGL3-BCRP 3'UTR共轉染后，熒光素酶活性明顯降低(Fig 3，P＜0.05)，表明miR-181能夠與BCRP mRNA-3'UTR區(qū)靶向結合。

Fig 3 Binding of miR-181a and BCRP mRNA-3'UTR region(detected by Luciferase reporter assay)

2.4 qRT-PCR、Western blot檢測誘導 MCF-7/MX細胞中miR-181a過表達后BCRP等耐藥蛋白mRNA及蛋白表達水平變化 接下來，通過誘導miR-181a高表達，檢測乳腺癌細胞BCRP表達的變化，考察miR-181a對BCRP表達的負性調控作用。首先，我們將miR-181a mimic轉染到MCF7/MX耐藥細胞中，48h后，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與NC mimic轉染組相比，轉染 miR-181a mimic后導致miR-181a低表達的MCF-7/MX細胞中miR-181a的表達增加約100倍(Fig 4，P＜0.05)，表明轉染miR-181a mimic成功誘導MCF-7/MX細胞miR-181a高表達。觀察miR-181a過表達的MCF-7/MX細胞中BCRP、MRP、LRP、P-gp的 mRNA 及蛋白表達水平變化。結果發(fā)現(xiàn)，與NC mimic轉染組相比，miR-181a mimic轉染誘導miR-181a過表達后，可抑制BCRP表達，通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-181a過表達的MCF-7/MX細胞BCRP mRNA表達明顯下降(Fig 5，P＜0.05)。進一步通過 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，BCRP蛋白表達亦明顯下降(Fig 6A、B，P＜0.05)，而MRP、P-gp、LRP等耐藥蛋白的mRNA表達和蛋白水平均無明顯改變(Fig 5、Fig 6，P＞0.05)，說明miR-181a具有選擇性靶向抑制BCRP表達的作用。

2.5 抑制MCF-7中miR-181a表達可增加BCRP表達 以上研究結果提示，誘導miR-181a高表達可靶向抑制MCF-7/MX乳腺癌耐藥細胞BCRP表達。為了驗證抑制乳腺癌藥物敏感細胞MCF-7(miR-181a高表達)中內源性miR-181a表達，能否會增加BCRP表達，我們將miR-181a inhibitor轉染至MCF-7細胞，構建miR-181a低表達的MCF-7細胞模型，檢測BCRP表達，反向驗證miR-181a對BCRP表達及功能的靶向調控作用。轉染48 h后，我們通過qRT-PCR法檢測miR-181a在MCF-7中的表達水平，與NC inhibitor轉染組相比，miR-181a inhibitor轉染的MCF-7細胞中，miR-181a的表達降低了5倍左右(Fig 7，P＜0.05)，說明 miR-181a inhibitor轉染可抑制MCF-7細胞中內源性miR-181a表達。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，使MCF-7細胞miR-181a低表達后，BCRP mRNA表達明顯增加(Fig 8，P＜0.05)。進一步通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，BCRP蛋白表達亦明顯增加(Fig 9A、B，P＜0.05)，而 MRP、P-gp、LRP等耐藥蛋白的mRNA表達和蛋白水平均無明顯改變(Fig 8、Fig 9，P＞0.05)，說明抑制乳腺癌藥物敏感細胞MCF-7內源性miR-181a的表達，可特異性增加BCRP表達。

Fig 4 Expression of miR-181a in MCF-7/MX cells(detected by qRT-PCR)

Fig 5 mRNA expressions of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7/MX cells(detected by qRT-PCR)

3 討論

研究表明，miRNA可與靶基因互補結合，從而負性調控靶基因的表達與功能，因此，發(fā)現(xiàn)并研究具有與BCRP靶向結合及負性調控作用的miRNA，對于逆轉BCRP介導的MDR具有重要意義。為了發(fā)現(xiàn)參與BCRP表達負性調控的miRNA，選取合適的細胞模型十分重要。以往研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)BCRP高表達的細胞系都可由MX誘導，因此，有人把BCRP稱為MX耐藥蛋白。基于此，本研究選取了乳腺癌耐藥細胞MCF-7/MX和乳腺癌敏感細胞MCF-7進行研究。

Fig 6 Protein expression levels of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7/MX cells(detected by Western blot)

Fig 7 Expression of miR-181a in MCF-7 cells(detected by qRT-PCR)

Fig 8 mRNA expressions of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7 cells with low expression of miR-181a(detected by qRT-PCR)

Fig 9 Protein expressions of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7 cells with low expression of miR-181a(detected by Western blot)

miR-181a最初發(fā)現(xiàn)于人惡性膠質瘤，發(fā)揮抑癌miRNA 功能［7］。在乳腺癌［8］、胃癌［9］miR-181a 表達升高，發(fā)揮類似癌基因的功能。此外，miR-181a與腫瘤細胞多種表型相關，如增殖［10］、凋亡［11］和耐藥［12］等。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中 miR-181a表達水平可用于乳腺癌的早期診斷與轉移［12］和患者預后的生物標志物［13］。然而，miR-181a在乳腺癌耐藥中的作用如何，目前尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，miR-181a在MCF-7/MX耐藥細胞中(BCRP高表達)下調，提示miR-181a可能參與BCRP表達的負性調控。生物信息學是預測miRNA與靶基因是否具有結合位點的有效方法，我們通過Targetscan預測miR-181a靶基因，發(fā)現(xiàn)BCRP是眾多靶基因之一，且miR-181a與BCRP-3'UTR區(qū)具有結合位點，進一步提示miR-181a可能是負性調控BCRP表達的miRNA。

接下來我們通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌耐藥細胞MCF-7/MX(BCRP高表達)中miR-181a表達水平明顯低于乳腺癌敏感細胞MCF-7(BCRP低表達)，進一步表明miR-181a表達可能與BCRP表達負相關。進一步通過熒光素酶報告基因分析，證實了miR-181a可與BCRP-3'UTR靶向結合，進而提示了miR-181a可能通過PTGS(post-transcriptional regulation)方式抑制BCRP表達。為了證實miR-181a與BCRP-3'UTR結合后是否可抑制BCRP表達，我們首先以BCRP過表達的MCF-7/MX乳腺癌耐藥細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)給予miR-181a mimic誘導MCF-7/MX中miR-181a過表達后，可抑制BCRP表達。研究結果首次證實了miR-181a對BCRP表達的靶向調控作用。以往研究發(fā)現(xiàn)miR-181a一些靶基因，例如 p27［14］、RalA［10］、K-ras［15］等。我們的研究結果證實，BCRP亦是miR-181a的新的功能靶基因。那么，miR-181a對其他耐藥蛋白作用如何?對BCRP表達的抑制作用是否特異?我們發(fā)現(xiàn)，MCF-7/MX中miR-181a過表達后，對P-gp、MRP、LRP的表達無明顯影響。這些結果證實了誘導miR-181a表達可特異性抑制BCRP表達。

以上研究結果表明，miR-181a可使BCRP過表達的MCF-7/MX乳腺癌耐藥細胞中BCRP表達被特異性抑制，那么，在BCRP低表達的乳腺癌敏感性細胞中(miR-181a高表達)，抑制miR-181a的表達水平，是否會引起B(yǎng)CRP表達變化?我們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌敏感性細胞MCF-7轉染 miR-181a inhibitor，使miR-181a表達下調后，細胞中BCRP表達升高。同時，與MCF-7/MX結果類似，抑制miR-181a表達，對P-gp、MRP、LRP的表達無明顯影響。這個研究結果從反方向進一步證實了miR-181a對乳腺癌中BCRP表達的調控作用。

綜上，我們的研究證明，miR-181a可靶向抑制乳腺癌細胞BCRP表達，提示miR-181a可能成為影響B(tài)CRP介導的乳腺癌MDR的關鍵靶點。

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