靈芝多糖聯合二甲雙胍預防糖尿病大鼠主動脈病變及對VEGF表達的影響

喬 進，竇志華，吳 鋒，孟國梁，陳 惠，鄭惠華

(南通市第三人民醫院1.藥劑科、2.藥理學系，江蘇 南通 226001;3.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通 226006)

糖尿病血管病變是糖尿病(diabetes mellitus，DM)慢性并發癥之一，其患病、發病率高，嚴重危害人體健康，影響人們的生活質量，是糖尿病患者致殘及死亡的首要原因。國內研究發現:首次篩查并發癥的糖尿病人群中，一項及以上大血管病變患病率達 38.3%［1］。靈芝多糖(ganoderma lucidum poly- saccharide，GLPs)為真菌靈芝［Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst］中提取出的以 β(1→3)糖苷鍵為主鏈的多糖［2］。二甲雙胍(metformin)為臨床常用降糖藥之一，具有明顯降糖和改善胰島素抵抗的作用，近年來研究證實了其具有一定的防治糖尿病血管并發癥和保護心血管的作用［3］。吳鋒等［4］研究發現，GLPs能抑制大鼠體內氧化應激。筆者［5］證實GLPs可有效抑制血清糖基化終末產物及增強體內CAT、GSH-Px活性來保護主動脈內皮功能。聯合應用這兩種藥物治療糖尿病心血管疾病具有理論上的優點，即在降低血糖的同時抑制體內氧化應激水平。但兩藥聯合應用其療效是否優于單用，尚未見報道。本研究建立2型糖尿病大鼠模型，觀察GLPs聯合二甲雙胍對2型糖尿病大鼠胸主動脈病變的抑制作用，探討其可能作用機制，為臨床合理應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠80只，♂♀各半，體質量160～180 g，南通大學實驗動物中心提供，許可證號:FYXK(蘇)2007－0021。

1.2 藥品與儀器 靈芝多糖(江蘇安惠生物科技有限公司，批號:100601)，純度:75.61%，以0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)配置成溶液;二甲雙胍(上海信誼天平藥業有限公司，批號:67100507);鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)，臨用前用0.1 mol·L－1檸檬酸緩沖液配成濃度為1%的STZ溶液;過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所產品);第2代免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司);兔抗VEGF多抗(武漢博士德生物工程有限公司);小鼠抗β-actin多克隆抗體(上海康成生物工程有限公司);辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG(上海康成生物工程有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(海門碧云天生物研究所)。One Touch血糖儀(美國強生公司);日立7170A全自動生化分析儀(日本日立公司);BH-NIC-B型倒置顯微鏡(日本O-lympus公司);蛋白電泳儀(美國 Bio-Rad公司);SH-100型凝膠圖像分析儀(上海復旦四星高科技技術公司)。

1.3 動物分組與給藥 SD大鼠80只，分為正常對照組和造模組。正常對照組10只，給予普通飼料喂養。造模組70只給予高脂飲食(基礎飼料70%、脂肪20%、蛋黃粉5%、奶粉5%)，喂養4周后禁食12～14 h，予STZ 30 mg·kg－1腹腔注射。1 周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1即造模成功，繼續高脂飲食。取40只成模大鼠隨機分為4組:糖尿病組、靈芝多糖組(靈芝多糖600 mg·kg－1)、二甲雙胍組(二甲雙胍600 mg·kg－1)、聯合用藥組(靈芝多糖300 mg·kg－1+二甲雙胍 300 mg·kg－1)。每日上午11∶00時灌胃給藥，qd，正常對照組和糖尿病組予生理鹽水灌胃，連續給藥12周。

1.4 觀察指標

1.4.1 血糖測定 12周末，禁食14～16 h，大鼠尾靜脈取血測空腹血糖。

1.4.2 血清CAT、GSH-Px含量測定 用CAT分解H2O2，再加入鉬酸銨的方法測CAT活力，用酶促反應的速度表示GSH-Px的活力，具體操作法按試劑盒說明進行。

1.4.3 血清 TC、TG 水平測定 取血，2 000 r·min－1分離血清，日立7170A全自動生化分析儀測定血清TC、TG含量。

1.4.4 病理組織學觀察 取胸主動脈用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，常規HE染色，光鏡觀察胸主動脈病理組織學變化。

1.4.5 免疫組化檢測主動脈VEGF的表達 取部分胸主動脈，4%多聚甲醛固定，24 h內石蠟包埋，切片。采用免疫組織化學法檢測胸主動脈中VEGF的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。各抗體按1∶50的方法稀釋，以PBS替代一抗作為陰性對照，將切片置于高倍鏡下(×200)，每張切片隨機選取8～10個視野，細胞胞膜和胞質內棕黃色顆粒即為陽性信號。采用JEDA801D型形態學圖像分析軟件測定陽性信號所占面積及平均灰度，二者乘積(即積分光密度值)越大表明組織中該抗原含量越高。

1.4.6 免疫印跡檢測VEGF蛋白的表達 取100 mg胸主動脈，置入組織裂解液(含有蛋白酶抑制劑)提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100 V;300 mA轉膜150 min至PVDF膜上;含有5%脫脂奶粉PBST室溫封閉1 h，分別加入VEGF和β-actin抗體4℃過夜，再加相應的二抗室溫反應1 h，洗膜后暗室加ECL，X線膠片曝光后顯影、定影。用四星圖像處理系統測定各組目的蛋白表達量與內參(β-actin)表達量的比值，取均值。

1.5 統計學分析 采用Stata10.0統計軟件分析處理數據，計量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析，q檢驗。

2 結果

2.1 大鼠空腹血糖 糖尿病組空腹血糖水平高于正常對照組，差異有顯著性(P＜0.01)。用藥組空腹血糖水平均低于糖尿病組(P＜0.01)，其中聯合用藥組下降幅度最大。見Tab 1。

Tab 1 Blood glucose in rats of each group(±s，n=10)

Tab 1 Blood glucose in rats of each group(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs DM

Group Blood glucose/mmol·L －1 CON 3.51 ±0.25##DM 19.13 ±0.81＊＊GLPs 11.16 ±0.33＊＊##Met 13.77 ±0.57＊＊##COM 7.35 ±0.64*##

2.2 大鼠血清CAT、GSH-Px含量測定 與正常對照組相比，糖尿病組大鼠血清CAT、GSH-Px活性降低(P＜0.01)，用藥組大鼠血清 CAT、GSH-Px活性有不同程度的升高(P＜0.05)，其中聯合用藥組升高最為明顯(P＜0.01)，效果強于單獨用藥組(P＜0.05)。見 Tab 2。

Tab 2 CAT and GSH-Px levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

Tab 2 CAT and GSH-Px levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group CAT/kU·g－1 GSH-Px/kU·g －1 CON 14.21 ±2.15 2598.13 ±126.75 DM 4.24 ±0.51＊＊ 1321.12 ±108.17＊＊GLPs 8.12 ±1.23# 1759.52 ±152.16#Met 7.15 ±1.47# 1680.43 ±135.15#COM 12.19 ±1.18##△ 2212.43 ±178.41##△

2.3 大鼠血清TC、TG水平測定 與正常對照組相比，糖尿病組血清TC、TG水平明顯升高(P＜0.01)，與糖尿病組相比，各治療組血清TC、TG水平明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，與單獨用藥組相比，聯合用藥組血清TC、TG水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。見Tab 3。

2.4 胸主動脈病理學變化 實驗結束取大鼠胸主動脈橫斷面切片行病理學檢查，HE染色可見，正常對照組:血管內膜結構清晰，表面光滑，內皮細胞形態規則，無脫落;糖尿病組:內膜明顯增厚，表面不光滑，內皮細胞突起，形態不規則，中膜明顯增厚，平滑肌細胞排列紊亂;靈芝多糖組:內膜略微增厚，表面不光滑，中膜輕度增厚，平滑肌細胞排列紊亂;二甲雙胍組:形態比糖尿病組略微好轉，中膜未見明顯增厚;聯合用藥組:內膜較光滑，內皮細胞排列較整齊，脂質沉積較模型組少，中膜未見明顯增厚，平滑肌細胞排列較整齊，程度較糖尿病組明顯減輕。見Fig 1。

Tab 3 TC and TG levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

Tab 3 TC and TG levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

＊＊ P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Met or GLPs

Group TC/mmol·L －1 TG/mmol·L －1 CON 1.58 ±0.21 0.46 ±0.09 DM 7.54 ±0.35＊＊ 2.51 ±0.23＊＊GLPs 4.98 ±0.39# 1.59 ±0.11#Met 5.23 ±0.41# 1.61 ±0.15#COM 2.17 ±0.16##△△ 0.78 ±0.14##△

2.5 免疫組化檢測胸主動脈VEGF的表達 棕褐色為目標蛋白表達。與正常對照組相比，糖尿病組大鼠主動脈VEGF表達明顯增強(P＜0.01)。與糖尿病組相比，3個治療組VEGF的表達明顯降低(P＜0.05)，其中聯合用藥組蛋白表達最低(P＜0.01)，低于單獨用藥組(P＜0.05)。見Fig 2、Tab 4。

2.6 蛋白印記檢測胸主動脈VEGF的表達 內參β-actin在各組中有均一表達，VEGF在各組中的蛋白條帶深淺不一，見Fig 3。

Fig 3 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group

Tab 4 Expression of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

Tab 4 Expression of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group VEGF CON 0.35 ±0.11 DM 3.24 ±0.24＊＊GLPs 2.09 ±0.17#Met 2.16 ±0.15#COM 0.71 ±0.08##△

用四星圖像處理系統測出各組蛋白表達與βactin的表達量，計算出比值。與正常對照組相比，糖尿病組大鼠主動脈VEGF表達明顯增強(P＜0.01)。與糖尿病組相比，3個治療組的蛋白表達均下調(P＜0.05)，聯合用藥組組下調最為明顯(P＜0.01)。見Tab 5。

3 討論

本研究通過高脂飲食配合注射小劑量STZ誘導2型糖尿病模型，聯合應用靈芝多糖與二甲雙胍干預，結果提示糖尿病組大鼠實驗期間血糖維持高水平，聯合用藥組血糖明顯低于模型組(P＜0.01)，并明顯低于單獨用藥組(P＜0.05)。

Tab 5 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

Tab 5 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group VEGF CON 0.25 ±0.01 DM 0.99 ±0.02＊＊GLPs 0.73 ±0.01#Met 0.76 ±0.02#COM 0.47 ±0.02##△

糖尿病血管病變是糖尿病常見的嚴重慢性并發癥之一。研究表明，氧化應激及炎癥反應在糖尿病發生發展中起重要作用［6］。干預氧化應激既可以消除病因，如恢復血糖、血脂水平;也可從病理環節著手，如切斷氧化應激發生、消除氧化應激產物等。在體內高糖環境下，機體一方面清除氧自由基酶(CAT、GSH-Px)的活性降低，另一方面體內的氧化應激作用增強，造成了大量氧自由基在體內積聚，導致活性氧連鎖反應，從而促進一系列糖尿病并發癥的發生和發展［7］。同時，氧化應激的發生和發展與血清中TC、TG水平有關［8］。本研究中，糖尿病組大鼠胸血清TC、TG含量明顯升高(P＜0.01)，血清CAT、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)。聯合用藥組血清 TC、TG含量明顯降低(P＜0.01)，血清CAT、GSH-Px活性明顯升高(P＜0.01)，效果優于單獨用藥組(P＜0.05)，提示在藥物總的劑量不變的前提下，靈芝多糖和二甲雙胍聯合使用能減少TC、TG含量，即降低血脂水平，增強清除氧自由基酶的活性，抑制體內氧化應激的形成，較單獨用藥更好的增強機體抗氧化能力。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等致炎因子參與介導糖尿病的發生和炎癥損傷［9］。因此，抑制致炎因子及其相關信號通路是防治糖尿病血管病變的重要策略之一。血管內皮細胞參與血管內外物質交換和血管新生，具有重要生理作用。血管內皮細胞損傷常常是糖尿病血管并發癥和高血壓等疾病的始動環節，并貫穿疾病整個過程［10］。因此，對血管內皮細胞的保護已成為治療糖尿病大血管病變研究的重要方向。作為血管新生相關因子，VEGF是內皮細胞特異性的促有絲分裂原和趨化因子，通過促進內皮細胞增殖，加速新生血管的形成［11］。張力等［12］研究發現，VEGF與糖尿病的血管病變密切相關。VEGF屬血小板源性生長因子家族，其受體僅表達于血管內皮細胞表面，能刺激血管內皮細胞的有絲分裂和血管的發生，提高單層內皮的通透性［13］，血清VEGF水平上升、血管通透性增加、血管內皮細胞功能障礙與糖尿病進程密切相關［14－15］。給藥12周末，光鏡下觀察各組大鼠胸主動脈內膜結構發現，同等劑量的靈芝多糖于二甲雙胍對主動脈內膜的保護作用相當，總藥物劑量不變情況下，兩種藥物聯合使用能增強對主動脈內膜的保護作用，結果優于單獨用藥。

VEGF的生物學功能主要表現在:(1)促進血管通透性;(2)促進血管內皮細胞有絲分裂，使血管生成;(3)刺激人的內皮細胞產生一氧化氮(NO)，并使其濃度呈劑量依賴性增加，起到維持血管作用;(4)促進內皮細胞增殖，加快血管內皮愈合。有研究表明:血清VEGF與血管并發癥密切相關［16］。在對VEGF與大血管病變關系的研究中發現，合并有糖尿病大血管病變的患者，血清VEGF較對照組明顯升高。動脈粥樣斑塊形成時，激發了血管內皮細胞、血小板、單核細胞等，產生大量的VEGF，同時由于動脈粥樣硬化組織存在著局部缺血，而缺血、缺氧是誘發多種組織細胞分泌VEGF增加的重要原因［17］。Sun 等［18］進一步研究發現，缺氧應激可能造成細胞功能受損，部分細胞的功能代償使VEGF表達上調，VEGF水平升高更進一步加重脂肪細胞功能障礙的二元受損。T2DM空腹VEGF水平上調，增加機體腎臟、視網膜等血管性病變的發生。Elshal等［19］研究表明鏈脲佐菌素建模T2DM大鼠血管通透性高，VEGF水平上升。本研究中，糖尿病大鼠血管病變的同時伴隨VEGF蛋白表達的上調，證實VEGF過度表達是導致糖尿病血管病的因素之一。聯合用藥治療后，大鼠主動脈VEGF的表達明顯下降(P＜0.01)。總藥物劑量不變情況下，聯合用藥對大鼠主動脈VEGF表達的抑制作用要強于單獨用藥組(P＜0.05)。

綜上所述，在2型糖尿病大鼠模型中，聯合應用靈芝多糖和二甲雙胍在降血糖和改善主動脈病變程度效果優于單藥使用，其機制可能與降低血脂水平、調節氧化應激、下調主動脈病變過程中VEGF的表達有關。聯合這兩種藥物對臨床治療糖尿病有一定的指導意義。有關VEGF的表達是否為糖尿病血管病變的決定因素，聯合用藥在臨床上的適宜劑量、可能產生的副作用在今后將做進一步研究。

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