豇豆葉綠體微衛星標記的開發及其在近緣種的通用性研究

潘磊 ，李依 ，郭瑞 ，張鳳銀 ，曾長立 ，胡志輝 ，吳華 ，陳禪友

（1.湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心，武漢，430056；2.江漢大學生命科學學院）

豇豆（Vigna unguiculata）（2n=2x=22），又名豆角、長豆角、帶豆等，屬豆科豇豆屬一年生草本植物。豇豆起源于非洲，中國是其次生起源中心，它在我國栽培歷史悠久，栽培面積大，南北各地均有分布。當前，豇豆的DNA分子標記研究在國內外越來越受到關注[1]。特別是在豇豆的遺傳多樣性及品種（系）間的遺傳關系等研究方面，開展了多種分子標記技術的研究，如RFLP[2]，AFLP[3]，RAPD（Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性 DNA）[4，5]、ISSR（Inter－simple sequence repeat，簡單序列重復區間）[6]。 近年來，借助比較基因組學的技術手段，研究者們將豇豆近緣種——普通豇豆SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性）[7]和普通豇豆SSR（Simple sequence repeat，簡單序列重復）[8，9]等分子標記，成功用于長豇豆基因組的研究。

然而，豇豆核外基因組微衛星標記的研究，特別是葉綠體微衛星（Chloroplast simple sequence repeat，cpSSR）標記的發掘及其應用研究尚未見報道。Powell等[10]首次提出葉綠體cpSSR標記技術。與核基因組SSR標記相比，葉綠體基因組DNA（Chloroplast genome DNA，cpDNA） 呈單親遺傳模式、結構簡單、多拷貝、分子量小等特點，此外，cpSSR標記還兼有核基因組SSR標記的共顯性、高度變異和多態性等特點，可以用于種質資源分類[11]、親緣關系鑒定[12]、遺傳多樣性[13，14]、遺傳結構[15]、系統發生學等研究[16，17]。

開發cpSSR標記的傳統策略是構建基因組文庫和測序，然后設計引物進行篩選，以獲得cpSSR引物，但是從植物組織中提取高純度cpDNA十分困難，而且費時費力。當前，采用生物信息學技術方法，充分發掘公共數據庫資源中的葉綠體基因組序列，根據cpSSR側翼序列的保守性，設計篩選cpSSR引物是一條經濟且便捷的途徑。

雖然豇豆全基因組測序尚未完成，但是豇豆葉綠體全基因組已經測序完成并公布。本研究通過下載公共數據庫中的豇豆葉綠體基因組全序列，分析豇豆葉綠體基因組的結構和組分特征，揭示豇豆cpSSR組成與分布特點，并檢驗豇豆cpSSR引物在豆科物種間的通用性，以便為豇豆cpSSR標記在其近緣種的群體分化、遺傳多樣性和系統發育等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 葉綠體微衛星篩選

從 GenBank公共數據庫中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載豇豆（V.unguiculata）葉綠體基因組全序列（NC_018051），對豇豆葉綠體基因組全序列進行分析，篩選微衛星序列。單堿基微衛星采用軟件Tandem Repeats Finder 4.04查找[18]；多堿基微衛星采用SSRhunter 1.3軟件進行分析[19]，搜索條件按設置為單堿基微衛星最小重復次數為10、二和三堿基的完全重復微衛星最小重復次數分別為5和4、四堿基及四堿基以上的微衛星最小重復次數均為3。在每個SSR位點的上下游側翼序列各為150 bp。

此外，采用DOGMA軟件 （Dual Organellar Genome Annotator）（http://dogma.ccbb.utexas.edu/）對葉綠體基因組結構進行分析。

1.2 cpSSR引物設計

基于所獲得的葉綠體微衛星序列，利用在線引物設計軟件 Primer 3.0（http://frodo.wi.mit.edu/）分析微衛星的側翼序列并進行引物設計。主要參數設置為引物長度18～22 bp，以20 bp為最佳；引物退火溫度50～60℃，以55℃為最佳，上游和下游的引物退火溫度之差在5℃以內；GC含量40%～70%，最適為50%；預期PCR產物長度為100～400 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 供試的豆類樣本材料

本研究在對引物進行擴增檢測時，采用了19份豆類種質資源，包括10份豇豆材料，5份菜豆材料，3份豌豆材料和1份利馬豆材料（表1）。

1.4 PCR擴增和電泳分析

PCR反應體系總體積為20 μL，含有1×PCR buffer，20 ng DNA 模 板 ，4 nmol dNTP，30 nmol MgCl2，引物 10 pmol，0.5 U Taq DNA 聚合酶[天根生化科技（北京）有限公司]。在Mastercycler gradient型PCR儀（德國，Eppendorf公司）上進行擴增。PCR擴增反應程序為94℃預變性5 min；然后進行35個循環，每個循環包括 94℃變性 30 s，50～60℃退火 30 s，72℃延伸 40 s；最后 72℃延伸 5 min。

采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠（Acrylamide∶Bis=19∶1）檢測擴增產物。將PCR產物與上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.025%溴酚藍和0.025%二甲苯青藍）等體積混合，在95°C變性5 min后，立即冰浴3 min，每次點樣量2.5 μL，恒功率55 W預電泳40 min，然后恒功率50 W電泳1.5 h。電泳完畢，經過固定、銀染、顯色并用數碼相機拍照。

表1 供試的豆類樣品信息

表2 52個cpSSR在豇豆葉綠體基因組上的分布

電泳后，統計每一樣品擴增的DNA條帶數及其多態性，在同一電泳遷移位置上，有DNA擴增條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

2 結果與分析

2.1 豇豆葉綠體基因組cpSSR的分布

豇豆葉綠體基因組全序列分析表明，其基因組大小為152 415 bp，總GC含量為35.2%。豇豆葉綠體基因組的結構包括1個長單拷貝序列（Long single copy sequence，LSC）、1個短單拷貝序列 （Short singlecopysequence，SSC）及 2 個反向重復序列（Inverted repeat，IR）。其中，LSC約81 kb分布區域為1～81 468 bp，IRa約 26 kb分布區域為 81 469～107 351 bp，SSC 約 19 kb分 布 區 為 107 352～126 250 bp，IRb大約26 kb分布區域為126 251～152 415 bp。

從豇豆葉綠體基因組上共搜索出52個微衛星（表2），分布頻率為每2 931 bp有1個 cpSSR；微衛星核心重復區及側翼序列總長度為16 213 bp，占基因組全長的10.63%。豇豆cpSSR的分布范圍較大，從7 245 bp到152 001 bp都有分布，但是其分布并不均勻，主要集中在LSC區，少量的在SSC區 ，而在IR區沒有。在LSC區和SSC區分布的cpSSR分別為48個（92.3%）和 4個（7.7%）。

表3 52個豇豆葉綠體cpSSR的重復基序特點

2.2 豇豆葉綠體基因組cpSSR的重復基序特點

根據微衛星核心重復基序的結構特點[20]，可將微衛星可分為3種類型，即完美型、非完美型和復合型。完美型指的是微衛星序列沒有中斷或附近沒有其他種類基序的重復序列；非完美型指的是同種重復基序被3個堿基以下的非重復序列所間隔；復合型指一種重復基序與其他種類的重復基序被3個以下的非重復序列所間隔。在所獲得的52個豇豆cpSSR中，完美型為48個，非完美型為4個，無復合型（表3）。這表明，在豇豆葉綠體基因組cpSSR中以完美型和非完美型微衛星為主。此外，對核心區的重復次數分析發現，重復次數的變化范圍為4～19次，其中核心重復次數為10次的微衛星有14個（26.9%），而核心重復次數為11次的微衛星有11個（21.2%），兩者累計所占比例為48.1%，幾乎占全部微衛星數量的1/2。

依據重復基序的堿基數目差別，在這52個豇豆cpSSR中，單堿基重復基序微衛星共有33個（完美型29個和非完美型4個），占63.5%，而 A和T是單堿基重復基序的主要類型，未見C或者G的單堿基基序（表3）。二堿基重復基序的微衛星有14個，占26.9%，以AT和TA為主；三堿基重復基序有5個，占9.6%，堿基類型包括AAT （2個）、TTA（1個）、TAA（1 個）、ATA（1 個）。 由此可見，在豇豆葉綠體微衛星中，重復基序的堿基主要以A和T為主。

2.3 cpSSR引物的設計與篩選

利用在線引物設計軟件Primer 3.0分析上述52個豇豆葉綠體微衛星序列，從中設計并合成10對cpSSR引物，通過對10份豇豆樣品的PCR檢測，發現其中8對cpSSR引物具有多態性（圖1），且PCR產物片段位于100～400 bp（表4）。

檢測上述8對多態性豇豆cpSSR在其近緣種中的可轉移性（圖2）。選取豇豆的3個近緣物種豌豆、利馬豆和菜豆（共9份樣品）進行擴增，結果表明，這8對豇豆cpSSR引物均可以在這三3個近緣種中成功擴增（表4）。

圖1 引物CPM7在10份豇豆樣品中擴增產物的電泳圖譜（8%PAGE）

在豌豆中具有多態性的引物有CPM1、CPM3和CPM6，均檢測到2個等位基因，其余5對cpSSR引物為單態性；在菜豆中具有多態性的引物有CPM1、CPM2、CPM4、CPM5 和 CPM7，也均檢測到 2對等位基因，而其余3對cpSSR引物為單態性。

3 討論與結論

葉綠體基因組是單倍體，保守性較強，具有細胞質遺傳的特點，除少數植物例外，一般為單親遺傳，不發生重組[21]。由于在進化過程中，親代到子代的遺傳物質傳遞不涉及基因組重組，不會受到選擇壓力，而且位點發生的突變也容易保留，不會受到重組、缺失以及假基因等的干擾[22]。因此，具有葉綠體基因組特征的cpSSR分子標記技術廣泛應用于在植物種質資源鑒定、群體分化、系統分類和物種進化等研究領域[23，24]。

表4 8個豇豆cpSSR引物信息及在其近緣種中的可轉移性

圖2 引物CPM7在豌豆、利馬豆和菜豆樣品中擴增產物的電泳圖譜（8%PAGE）

在cpSSR分子標記的應用上，其瓶頸和難點是引物的設計與篩選。與核基因組SSR引物的開發類似，cpSSR引物開發的前提是獲取微衛星側翼的序列信息。隨著現代生物技術和基因組學的不斷進步，當前cpSSR分子標記的開發主要有兩種策略，一是直接進行葉綠體基因組測序，再設計篩選cpSSR引物；二是基于生物信息學手段，或者從公共數據庫的葉綠體基因組中發掘cpSSR引物，或者利用近緣物種的cpSSR進行種間的可轉移性檢測，以獲取cpSSR引物。對于前者而言，由于葉綠體基因組DNA的分離和純化難度較大，增加了測序難度和成本，因此，后者利用公共數據庫資源進行葉綠體cpSSR標記的開發，更加簡便和經濟。特別是隨著開展全基因組測序的植物物種越來越多，許多植物的葉綠體基因組如擬南芥[25，26]、黃瓜[22]、蝴蝶蘭[27]、柑橘[28，29]、菜豆[30]等的全序列或者部分序列已經釋放到公共數據庫中，極大促進了cpSSR分子標記的開發和應用。

豇豆的葉綠體基因組全序列剛公布不久，這為揭示豇豆葉綠體基因組特征，并開發豇豆cpSSR分子標記奠定了基礎。豇豆葉綠體基因組比較大（約153 kb），而一般植物的葉綠體基因組大小在120～170 kb[7，31]。

本研究通過對豇豆葉綠體全基因進行微衛星分布特征分析，發現在豇豆葉綠體基因組上分布有52個cpSSR，其序列總長約占葉綠體基因組全長的1/10。這些微衛星在豇豆葉綠體基因組上分布不均，分布的密集區域為LSC區，只有少數幾個微衛星分布在SSC區，而在IR區無微衛星分布。

這52個豇豆cpSSR在微衛星的序列特征上，以A/T為單堿基重復基序的微衛星為主 （63.5%），也包括少量的二堿基重復基序類型AT/TA和三堿基重復基序類型AAT/TTA/TAA/ATA；重復次數的變化范圍為4次到19次不等。因此，在豇豆cpSSR中，無論單堿基、二堿基或者三堿基重復基序，它們的堿基組成均以A/T為主要類型，未見C/G的堿基基序，而且重復次數變異范圍有限。cpSSR的這種堿基組成和重復特征可能與葉綠體的結構組成特點及其進化有關聯。

由于葉綠體基因組序列在物種間具有較高的保守性，cpSSR引物可以在不同種屬間進行跨種擴增，具有通用性。Ishii等[32]研究表明，水稻cpSSR標記在禾本科植物中具有較為廣泛的通用性。Diekmann等[33]從多年生黑麥草中發掘出9個cpSSR標記并檢驗其在黑麥草屬物種中的通用性。在園藝作物研究中，梁芳芳等[34]發現黃瓜cpSSR引物在其近緣種甜瓜、南瓜和西瓜中的通用性較好；Xue等[35]研究了中國蓮cpSSR在蓮屬中的通用性及多態性；Jiang等[36]從中國芒中開發出了在芒屬植物中具有通用性的cpSSR引物。而在木本植物研究中，韓鍵等[37]研究揭示了果梅cpSSR引物在李屬的桃、李、梅、杏、櫻桃等5個樹種中均具有通用性。

關于豆科植物的cpSSR分子標記研究鮮見報道。Angioi等[38]報道了所開發的菜豆屬cpSSR標記的通用性，并分析了其在豆科的羽扇豆、花生、蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、大豆和豌豆中的通用性。當前，對豇豆葉綠體基因組cpSSR分子標記的研究尚未見正式報道。

因此，本研究初步嘗試對豇豆cpSSR分子標記進行研究，設計篩選了8對多態性豇豆cpSSR引物，并在豇豆的近緣種豌豆、利馬豆和菜豆中成功擴增，表明了這些cpSSR引物在不同豆類物種之間具有較為廣泛的通用性。總之，本研究分析了豇豆基因組微衛星的序列組成和分布特點，并成功開發出具有種間通用性的豇豆cpSSR引物，這將為豇豆cpSSR分子標記應用于豆科物種開展群體遺傳學、系統發育與進化等研究奠定一定的基礎。

[1]張靜，彭海，陳禪友.分子標記在長豇豆遺傳分析中的應用進展[J].長江蔬菜，2010（16）：1－5.

[2]Fatokun C A,Danesh D,Young N D.Molecular taxonomic relationships in the genusVignabased on RFLP analysis[J].Theoretical and Applied Genetics,1993,86:97－104.

[3]Coulibaly S,Pasquet R S,Papa R,et al.AFLP analysis of the phenetic organization and genetic diversity ofVigna unguiculataL.Walp.reveals extensive gene flow between wild and domesticated types[J].Theoretical and Applied Genetics,2002,104:358－366.

[4]陳禪友，潘磊，胡志輝，等.長豇豆品種資源的RAPD分析[J].江漢大學學報：自然科學版，2008，36（4）：77－83.

[5]Fana S B,Pasquet R S,Gepts P.Genetic diversity in cowpea[Vigna unguiculata （L.）Walp.]as revealed by RAPD markers[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2004,51:539－550.

[6]Chen C Y,Peng H.Differentiation and phylogenetic relationship among different cultibars of asparagus bean（Vigna unguiculata （L.）ssp.sesquipedalis）assessed using ISSR markers[J].Nordic Journal of Botany,2010,28:251－256.

[7]Shaw J,Lickey E B,Schilling E E,et al.Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms:the tortoise and the hare III[J].American Journal of Botany,2007,94（3）:275－288.

[8]Kongjaimun A,Kaga A,Tomooka N,et al.An SSR－based linkage map of yardlong bean （Vigna unguiculata （L.）Walp.subsp.unguiculataSesquipedalis Group）and QTL analysis of pod length[J].Genome,2012,55（2）:81－92.

[9]Xu P,Wu X,Wang B,et al.Development and polymorphism ofVigna unguiculatassp.unguiculatamicrosatellite markers used for phylogenetic analysis in asparagus bean （Vigna unguiculatassp.sesquipedialis （L.）Verdc.）[J].Molecular Breeding,2010,25:675－684.

[10]Powell W,Morgante M,McDevitt R,et al.Polymorphic simple sequence repeat regions in chloroplast genomes:applications to the population genetics of pines[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the U-nited States of America,1995,99:7 759－7 763.

[11]李博，馮慧敏，王靜毅，等.基于cpSSR分子標記的香蕉種質資源分類[J].果樹學報，2011，28（6）：1 012－1 018.

[12]趙丹，隋心，孫曉艷，等.基于cpSSR標記的紅松天然群體自由授粉子代的父本分析 [J].經濟林研究，2011，29（4）：23－27.

[13]程麗莉，封海東，饒群，等.湖北省十堰地區野生板栗cpSSR 遺傳多樣性研究[J].果樹學報，2012，29（3）：382－386.

[14]邵丹,裴贏,張恒慶.涼水國家自然保護區天然紅松種群遺傳多樣性在時間尺度上變化的cpSSR分析[J].植物研究，2007，27（4）：473－474.

[15]張田,李作洲,劉亞令,等.獼猴桃屬植物的cpSSR遺傳多樣性及其同域分布物種的雜交漸滲與同塑[J].生物多樣性，2007，15（1）：1－22.

[16]Bucci G,González－Martínez S C,Le Provost G,et al.Range－wide phylogeography and gene zones inPinus pinasterAit.revealed by chloroplast microsatellite markers[J].Molecular Ecology,2007,16（10）:2 137－2 153.

[17]Yu H,Nason J D.Nuclear and chloroplast DNA phylogeography ofFicus hirta:obligate pollination mutualism and constraints on range expansion in response to climate change[J].New Phytologist,2013,197（1）:276－289.

[18]Benson G.Tandem repeats finder:a program to analyze DNA sequences[J].Nucleic Acids Research,1999,27（2）:573－580.

[19]李強，萬建民.SSRHunter，一個本地化的SSR位點搜索軟件的開發[J].遺傳，2005，27（5）：808－810.

[20]Weber J L.Informativeness of human （dC－dA）n,（dG－dT）n polymorphisms[J].Genomics,1990,7（3）:524－530.

[21]Birky C W.Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast genes:mechanisms and evolution[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1995,92:11 331－11 338.

[22]胡建斌，李建吾，梁芳芳，等.黃瓜葉綠體基因組全序列微衛星分布特征與標記開發[J].細胞生物學雜志，2009，31（1）：69－74.

[23]李博，劉合霞.葉綠體基因組微衛星標記（cpSSR）研究進展[J].安徽農業科學，2012，40（13）：7 638－7 639.

[24]Provan J,Powell W,Hollingsworth P M.Chloroplast microsatellites:new tools for studies in plant ecology and evolution[J].Trends in Ecology and Evolution,2001,16:142－147.

[25]王化坤，喬玉山，婁曉鳴，等.擬南芥葉綠體DNA全序列微衛星分布規律的分析[J].中國生物化學與分子生物學報，2006，22（10）：845－850.

[26]張揚勇，方智遠，王慶彪，等.擬南芥葉綠體SSR引物在甘藍上的應用[J].園藝學報，2011，38（3）：549－555.

[27]張君毅.蝴蝶蘭葉綠體DNA微衛星分析與標記開發[J].江西農業學報，2011，23（12）：31－33.

[28]Bausher M G,Singh N D,Lee S B,et al.The complete chloroplast genome sequence ofCitrus sinensis （L.）Osbeck var'Ridge Pineapple':organization and phylogenetic relationships to other angiosperms[J].BMC Plant Biology,2006,6:21.

[29]龔桂芝，洪棋斌，彭祝春，等.枳屬種質遺傳多樣性及其與近緣屬植物親緣關系的SSR和cpSSR分析[J].園藝學報，2008，35（12）：1 742－1 750.

[30]Desiderio F,Bitocchi E,Bellucci E,et al.Chloroplast microsatellite diversity inPhaseolus vulgaris[J].Frontiers in Plant Science,2012（3）:312.

[31]Clegg M T,Gaut B S,Learn G H,et al.Rates and patterns of chloroplast DNA evolution[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1994,91（15）:6 795－6 801.

[32]Ishii T,McCouch S R.Microsatellites and microsynteny in the chloroplastgenomes ofOryza and eightother Gramineae species[J].Theoretical and Applied Genetics,2000,100:1 257－1 266.

[33]Diekmann K,Hodkinson T R,Barth S.New chloroplast microsatellite markers suitable for assessing genetic diversity ofLolium perenneand other related grass species[J].Annals of Botany,2012,110（6）:1 327－1 339.

[34]梁芳芳，李瓊，胡建斌，等.黃瓜cpSSR引物的多態性與通用性[J].江西農業學報，2010，22（3）：1－4.

[35]Xue J,Wang S,Zhou S L.Polymorphic chloroplast microsatellite loci inNelumbo （Nelumbonaceae）[J].American Journal of Botany,2012,99（6）:240－244.

[36]Jiang J X,Wang Z H,Tang B R,et al.Development of novel chloroplast microsatellite markers forMiscanthus species （Poaceae）[J].American Journal of Botany,2012,99（6）:230－233.

[37]韓鍵，王化坤，練春蘭，等.果梅nSSR、cpSSR引物在李屬果樹上的通用性分析[J].果樹學報，2009，26（6）：830－835.

[38]Angioi S A,Desiderio F,Rau D,et al.Development and use of chloroplast microsatellites inPhaseolusspp.and other legumes[J].Plant Biology,2009,11（4）:598－612.