梅毒螺旋體重組蛋白Tp0965的表達與鑒定

周秀萍　楊長順　牛淑會　李樹平　陽大慶　付祥　曾鐵兵

【摘要】 目的：研究梅毒螺旋體（Tp）重組蛋白Tp0965（rTp0965）的表達并鑒定其免疫反應性，為進一步探討其在梅毒血清學診斷與疫苗中的應用價值奠定基礎。方法：構建Tp0965原核表達重組體pET-28a（+）/Tp0965，誘導轉化宿主菌表達重組蛋白，Ni-NTA親和層析法純化蛋白，Western blot鑒定其免疫反應性。結果：成功構建了原核表達重組體pET-28a（+）/Tp0965，經誘導高效表達了一分子量約為43 KDa的可溶性重組蛋白，純化蛋白純度>95%；Western blot顯示該純化蛋白能被梅毒患者血清特異性識別。結論：高效表達了可溶性rTp0965，該重組抗原有良好的免疫反應性。

【關鍵詞】 梅毒； 梅毒螺旋體； Tp0965； 重組抗原

近幾年我國梅毒發病率已居各類性傳播疾病（STDs）首位，尤其是胎傳梅毒和男-男同性伴艾滋病性梅毒呈顯著上升趨勢[1-2]。早期診斷和研發有效疫苗對防治梅毒具有重要意義。隨著梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）全基因組的解析，一些具有診斷和免疫保護價值的重組抗原陸續被表達和評價，然而迄今未發現能檢測出臨床各期梅毒的抗體的診斷抗原和能誘導完全保護作用的疫苗分子[3-7]。Tp0965是近年來發現的一種假想蛋白，其天然蛋白與梅毒患者血清有較好的免疫反應性，具有潛在的免疫診斷和免疫保護價值[8-9]。本研究克隆表達了Tp0965并鑒定其免疫反應性，為深入評價其免疫診斷和保護作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株和質粒 Tp（Nichols）梅毒菌株、pET-28a（+）質粒及宿主菌均為南華大學病原生物學研究所保存。

1.1.2 試劑和試劑盒 基因組DNA純化提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）、Ni-NTA親和層析柱為德國Qiegen公司產品；限制性核酸內切酶NdeⅠ和BamHⅠ、T4連接酶為NEB（北京）有限公司產品；PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為美國AxyPrep公司產品；DNA分子量標準、蛋白質分子量標準購自天根生化科技（北京）有限公司；HRP標記羊抗人IgG（二抗）、DNA高保真聚合酶為大連寶生物公司產品；增強化學發光法（ECL）蛋白印跡法檢測試劑盒為PIERCE公司產品。

1.1.3 臨床血清 梅毒陽性血清（經TPPA確診梅毒患者血清）、梅毒陰性血清（健康人血清）由懷化第一人民醫院檢驗科提供。

1.2 方法

1.2.1 Tp0965基因擴增 從GenBank獲取Tp0965基因序列，設計引物：上游引物F：GGAA TTC CAT ATG ATG ACC ACA GCA CAG AAA CT（斜體為NdeⅠ酶切位點序列）、下游引物R：CG GGA TCC TTT CCT CGC TGC ACT TTG G（斜體為BamHⅠ酶切位點序列）。按說明書以基因組DNA純化提取試劑盒提取Tp基因組DNA，以其為模板，PCR擴增Tp0965全長基因。PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.5 ?L、50 fmol/L引物各0.125 ?L、2.5 mmol/L dNTPs、DNA高保真聚合酶0.5 U、模板1 ?L，加水至25 ?L。擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃再延伸10 min。試劑盒回收PCR擴增產物。

1.2.2 重組表達質粒構建與鑒定 分別以NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR擴增產物與質粒pET-28a（+）、純化，T4連接酶連接。將構建的pET-28a（+）/Tp0965轉化E.coli BL21（DE3），篩選陽性克隆，經酶切及測序（上海Invitrogen公司）鑒定，獲得重組工程菌。

1.2.3 誘導表達 重組菌接種于LB培養基培養，30 ℃下以終濃度1.0 mmol/L IPTG誘導表達4 h。煮沸法提取全菌蛋白，SDS-PAGE分析條帶中目的蛋白的相對含量。

1.2.4 重組蛋白表達形式鑒定 冰浴超聲細菌裂解液裂解的破碎菌體，差速離心以去除殘留全菌，4 ℃、14 000 rpm離心20 min，收集上清和沉淀（包涵體），SDS-PAGE分析蛋白表達形式。

1.2.5 重組蛋白純化 最佳優化條件下大量誘導表達重組菌，裂解菌體經超聲破碎，離心收集上清，經Ni-NTA 親和層析柱純化，再經SDS-PAGE，UVP掃描分析蛋白純度。

1.2.6 重組蛋白免疫反應性鑒定 純化蛋白經電泳后轉印至硝酸纖維素（NC）膜，以1：100稀釋的10份混合梅毒陽性血清或健康血清（陰性對照）為一抗，以1：10 000稀釋的HRP標記羊抗人IgG為二抗進行Western blot，ECL顯影，鑒定重組蛋白免疫反應性。

2 結果

2.1 Tp基因PCR擴增 PCR擴增所得目的基因得到長度約為960 bp大小片段，與預期目的片段大小相符。

2.2 重組表達質粒構建與鑒定 重組表達質粒經雙酶切鑒定（圖1）和DNA測序（與GenBank上登錄基因序列完全一致）鑒定，表明pET-28a（+）/Tp0965表達質粒構建成功。

2.3 重組蛋白的誘導表達、表達形式及純化 誘導表達的菌體蛋白經SDS-PAGE電泳，在約43 KDa處可見一明顯條帶，與預期分子量大小一致，重組蛋白主要以可溶性形式存在，純化的重組蛋白經SDS-PAGE顯示出單一清晰條帶（圖2），UVP掃描顯示其純度達到95%以上。

2.4 重組抗原的免疫反應性鑒定 Western blot結果顯示，重組蛋白僅被梅毒患者混合血清識別，而不能被健康人血清識別（圖3），表明表達產物有良好的免疫反應性和特異性。endprint