栽培藍(lán)莓—園藍(lán)的抗氧化活性及其活性化合物的定性定量

簡(jiǎn)衛(wèi)琴+張枝潤(rùn)+韓中惠+柏石頭+張維明+趙聲蘭+李忠榮+邱明華

摘要：為測(cè)定栽培藍(lán)莓-園藍(lán)果實(shí)中的抗氧化活性及其總花色苷含量，以貴州產(chǎn)園藍(lán)鮮果為原料，經(jīng)甲醇處理、大孔吸附樹(shù)脂分離得出抗氧化活性最好的部位。然后對(duì)其進(jìn)行了制備分離得到一單體化合物，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，利用Rp-HPLC進(jìn)行了該化合物的含量測(cè)定。以該化合物為對(duì)照品，對(duì)園藍(lán)果實(shí)中總花色苷含量進(jìn)行了定量分析。研究表明：貴州產(chǎn)園藍(lán)提取物富含花青素部分1mg/mL濃度的抗氧化活性與等濃度的維生素C的活性相當(dāng)，鑒定的單體化合物為錦葵色素-3-O-葡萄糖，其純度達(dá)96%，園藍(lán)鮮果中總花青素平均含量為627.7mg/100g。指出了園藍(lán)鮮果花色苷含量高，主成分為錦葵色素-3-O-葡萄糖，花青素具有較好的抗氧化活性。建議每人每天食用2g園藍(lán)鮮果作為人體補(bǔ)充抗氧化劑的來(lái)源。

關(guān)鍵詞：園藍(lán)；抗氧化性；花色苷；錦葵色素-3-O-葡萄糖

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：16749944（2014）11007704

1引言

兔眼藍(lán)莓為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）野生兔眼越橘（Vaccinium ashei Reade）類品種中選育出來(lái)的栽培品種，因果實(shí)成熟前其顏色紅如兔眼而得名。園藍(lán)（Gardenblue）為兔眼藍(lán)莓栽培品種之一。藍(lán)莓具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，果實(shí)富含花青素、維生素、黃酮類化合物等[1]。花青素（Anthocyanin）又名花色素，屬類黃酮類化合物，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，多以糖苷形式存在，又稱花色苷。藍(lán)莓花青素種類豐富，有報(bào)道的花色苷有18種[2]。不同越橘品種總花青素含量差別較大。楊桂霞等對(duì)16種越桔果鮮果的花色苷含量做了測(cè)定，結(jié)果花色苷含量為258.76～613.18mg/100g[3]。花青素具有很多生物活性，如抗氧化活性，Li-Qion等研究發(fā)現(xiàn)飛燕草色素和花青素-3-O-葡萄糖為藍(lán)莓中主要抗氧化活性成分[4]；抗腫瘤活性，Andrea Bunea等研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓栽培品Torro的花青素（ARF-T）含量超過(guò)500μg/mL時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤B16-F10小鼠細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，同時(shí)ARF-T能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和提高脾細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性[5]；同時(shí)還具有降脂[6]、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟、降低DNA氧化損傷[7]等多種生物活性。目前藍(lán)莓總花青素含量測(cè)定方法主要有紫外、pH示差法及HPLC等，其中HPLC法快速、穩(wěn)定、方便、可靠[2]。本文以藍(lán)莓品種園藍(lán)的甲醇提取物為原料，采用活性追蹤的方法，對(duì)活性最好的部分進(jìn)行分離純化，采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS技術(shù)對(duì)得到花色苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并將其作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用HPLC法測(cè)定園藍(lán)中總花青素含量。

2儀器、材料與試劑

2.1儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；澳柯瑪冰柜（澳柯瑪股份有限公司）；XY-FD-50S鐘罩式凍干機(jī)（上海欣諭儀器有限公司）；超聲波清洗器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；21型可見(jiàn)光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；AV800 MHz核磁共振波譜儀（德國(guó)Brucker公司）；Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（英國(guó)Waters公司）。

2.2材料與試劑

園藍(lán)成熟果實(shí)于2012年8月份在貴州麻江藍(lán)莓種植基地采摘，采摘后于-4℃冰箱中存放；Diaion HP-20大孔吸附樹(shù)脂（日本三菱樹(shù)脂株式會(huì)社）；200-300目硅膠（青島譜科分離材料有限公司）；Sephadex LH-20凝膠（GE）；色譜純甲醇（Hipure Chem）；分析純85%磷酸（川東化工有限公司）；水為純凈水；其他試劑皆為分析純。

3方法分析

3.1兔眼藍(lán)莓花青素羥自由基清除率的研究

3.1.1待測(cè)液的制備

取一定量的園藍(lán)鮮果用榨汁機(jī)勻漿后，以1∶5料液比添加含有3%冰醋酸的甲醇溶液，浸泡1h后，超聲提取30min，過(guò)濾除去果渣，減壓濃縮，得到浸膏。浸膏以Diaion HP-20為固定相，純水、10%、30%、50%、100%甲醇水和50%丙酮水梯度洗脫，洗脫液經(jīng)TLC劃段，分為10段：Fr.1～10，把這10部分分別配成濃度為1mg/mL和10mg/mL的待測(cè)液。

3.1.2羥自由基清除率實(shí)驗(yàn)

采用Fenton體系測(cè)定個(gè)段位（Fr.1～10）對(duì)·OH的抑制作用。Fe2+與鄰二氮菲能夠生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物在536nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，A536與絡(luò)合物的含量存在線性關(guān)系，通過(guò)計(jì)算A536吸收值的變化，得到樣品對(duì)·OH的清除能力，測(cè)定方法見(jiàn)表1。

表1自由基清除率測(cè)定方法

溶液用量/mL1樣品空白1未損傷1損傷1樣品150mmol/L磷酸鹽緩沖溶液11111111樣品液10.251-1-10.250.75mmol/L鄰二氮菲1-1111110.75mmol/L FeSO41-1111110.01%H2O21-1-10.510.5蒸餾水12.510.7510.251-混勻后再37℃水浴60min，取出后立即在536nm 波長(zhǎng)處以空白管調(diào)零，測(cè)定其吸光度

清除率采用下列方法進(jìn)行計(jì)算：

·OH清除率（%） =（A樣品-A損傷）÷（A未損-A損傷）×100。

3.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備

3.2.1色譜條件

色譜柱4.6×250nm，ZORBAX SB-C18，Agilent；柱溫35℃；進(jìn)樣量5 μL；流量1.000mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)520nm；流動(dòng)相A為1%磷酸水，B為甲醇；洗脫梯度0～25min 20% （B）→30% （B）、25～35min 30% （B）→45% （B）、35～40min 45%（B）→50%（B）。endprint

3.2.2花色苷的分離純化

對(duì)上述浸膏過(guò)Diaion HP-20 柱后得到的Fr.10進(jìn)行分離純化。以硅膠為固定相，氯仿/甲醇/水為洗脫系統(tǒng)，梯度為8∶2∶0.2→7∶3∶0.5→6∶4∶1。通過(guò)HPLC分析檢測(cè)分為Fr.4.1～Fr.4.4。Fr4.4經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20純化得到化合物1。采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。

3.3總花青素含量的測(cè)定

3.3.1待測(cè)液的配制

（1）對(duì)照品配制。精密稱取化合物12200mg于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成022mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用022μm濾膜過(guò)濾備用，標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜分析圖見(jiàn)圖1。

（2）樣品液的配制。稱取園藍(lán)鮮果2.0000g（Md），碾碎，甲醇超聲提取，減壓濃縮，得浸膏0.3422g（Mt），精密稱取濃縮物0.0541g于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成5.4100mg/mL的供試品溶液，供試品溶液的HPLC色譜分析圖見(jiàn)圖1。

3.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取配制好的對(duì)照品溶液，按2.3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量分別為：1、2、3、4、5、7、10 μL，重復(fù)測(cè)試3次。以化合物1質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算得線性方程：y=903.19x+0.4347，R2=0.9999，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品化合物1在0.22～2.2μg與峰面積成良好線性關(guān)系。

3.3.3精密度實(shí)驗(yàn)

取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按3.2.1項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示峰面積RSD為1.65%。

圖1標(biāo)準(zhǔn)品錦葵色素-3-O-葡萄糖（A）、供試品溶

液（B）HPLC色譜圖

3.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取鮮果園藍(lán)按3.3.1中（1）段方法制備供試品溶液，室溫放置，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示峰面積RSD為1.21%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.5重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取鮮果園藍(lán)按3.3.1中（2）段方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果6份供試品溶液總峰面積的RSD為0.75%。

3.3.6加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取園藍(lán)鮮果浸膏50.4000mg，加標(biāo)準(zhǔn)品溶液5mL于10mL容量瓶中，用分析純甲醇定容得樣品液，平行3份。按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果加樣回收率分別為95.42%、94.71%和95.64%，RSD為0.51%。

3.3.7總花青素含量測(cè)定

取園藍(lán)鮮果按3.3.1中（2）方法制備供試品溶液，平行3份，按上述色譜條件進(jìn)檢測(cè)，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算，得到花青素的含量，浸膏中花青素含量計(jì)算公式如下：

xt%=Xj1Ct×10-3×Vj×100

式中：xt為提取物浸膏中花青素含量；Xj為供試品溶液5μL進(jìn)樣量中花青素含量（mg）；Ct為供試品溶液濃度（mg/mL）；Vj為供試品溶液的進(jìn)樣量（μL）。

凍干果中花青素含量計(jì)算公式如下：

xi%=xt×Mt1Md。

式中：xi為園藍(lán)鮮果中花青素含量；Mt為園藍(lán)鮮果提取物浸膏的質(zhì)量（g）；Md為園藍(lán)鮮果的質(zhì)量（g）。

4結(jié)果分析

4.1抗氧化作用

Diaion HP-20劃段后各Fraction的抗氧化活性如圖2所示，可知在高濃度下（10mg/mL）除Fr.1（糖）和Fr.8（紫色未知）活性較低外，其他各部分均有較好的抗氧化活性；但是低濃度（1mg/mL）除Fr.10的抗氧化活性與Vc的抗氧化活性相當(dāng)，其余部分的抗氧化活性明顯降低，而其中有520nm特征吸收峰的為Fr.10，說(shuō)明Fr.10為含花青素段。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，高、低濃度下花青素部分均有良好的抗氧化活性，且低濃度時(shí)的抗氧化活性與等濃度的維生素C的活性相當(dāng)。

2014年11月綠色科技第11期4.2化合物1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為紫色粉末，易溶于甲醇，ESI-MS：m/z 493[M+]，碎片離子峰331，通過(guò)核磁共振譜圖數(shù)據(jù)分析，化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)確定為錦葵色素-3-O-葡萄糖（malvidin 3-O-glucoside）[8]。經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測(cè)得其含量≧96%。

化合物1的波譜數(shù)據(jù)：1H-NMR （800 MHz，CD3OD）：9.062 （s，H-4）、8.017（s，H-2′，6′）、7.001（d，J = 0.8 Hz，H-8）、6.691（d，J=1.6Hz，H-6）、4.028（s，2 x-CH3）、5.378（d，J=8Hz，H-1″）、3.670（t，J=8Hz，H-2″）、3.579（t，J=8.8Hz，H-3″）、3.438（t，J=8.8Hz，H-4″）、3.942（q，J=2.4Hz，H-5″）、4.315（m，H-6″a）、4.090（m，H-6″b）；C13-DEPT（200 MHz，CD3OD）：162.59（C-2，q）、144.4（C-3，q）、135.72（C-4，t）、157.92（C-5，q）、102.46（C-6，d）、169.29（C-7，q）、93.96（C-8，d）、156.53（C-9，q）、112.25（C-10，q）、118.45（C-1′，q）、109.24（C-2′、C-6′，t）、148.35（C-3′、C-5′，q）、144.80（C-4′，q）、55.88（-CH3）、55.87（-CH3）、101.93（C-1″，t）、73.63（C-2″，t）、77.54（C-3″，t）、69.80（C-4″，t）、76.82（C-5″，t）、60.99（C-6″，d）。endprint

圖2高、低濃度下各段的抗氧化活性

4.3總花青素含量

從表2中可知，園藍(lán)鮮果甲醇提取物浸膏中花青素的百分含量為3669%，鮮果中總花青素平均含量為6277mg/100g。用相同的方法測(cè)得園藍(lán)凍干果中總花青素含量為4709g/100g。園藍(lán)鮮果花色苷中化合物1含量最高為1268mg/100g。

5結(jié)語(yǔ)

園藍(lán)提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性：非花青素部分在高濃度的情況下具有較好的抗氧化活性，而花青素部分在低濃度的情況下就能達(dá)到與高濃度時(shí)相當(dāng)?shù)目寡趸钚裕遗cVc的清除自由基的能力相當(dāng)，都說(shuō)明園藍(lán)花青素具有很好的抗氧化活性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還表明園藍(lán)花青素中，主成分為錦葵色素-3-O-葡萄糖。對(duì)其花青素含量進(jìn)行測(cè)定，不僅能為花青素的綜合利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，還可以指導(dǎo)人們對(duì)藍(lán)莓花青素的日常使用，據(jù)報(bào)道每人每天攝入花青素量約為12.5mg[9]，以此推算如果是食用以上的品種的藍(lán)莓鮮果，每人每天食用約2g園藍(lán)鮮果即可滿足攝入花青素的要求。

表2園藍(lán)鮮果花青素含量分析表

樣品編號(hào)1Xj/（×10～4mg）1xt%1xi%119.94313.67610.6290219.90413.66110.6264319.92413.66910.6277花青素平均含量19.92413.66910.6277

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱麟，凌建剛，康孟利，等.不同包裝方式對(duì)兔眼藍(lán)莓保鮮效果的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（3）：190～193.

[2] Gad G.Yousef，Allan F.Brown，Yayoi Funakoshi，et al.Efficient Quantification of the Health-Relevant Anthocyanin and Phenolic Acid Pro fi les in Commercial Cultivars and Breeding Selections of Blueberries （Vaccinium spp.）[J].J Agric Food Chem，2013（61）：4806～4815.

[3] 楊桂霞，范海林，李亞?wèn)|，等.RP-HPLC法測(cè)定栽培種越橘果中花色素苷的含量[J].藥物分析雜志，2005，25（10）：1222～1224.

[4] Li-Qiong Sun，Xiao-Ping Ding，Jin Qi，et al.Antioxidant anthocyanins screening through spectrum-effect relationships and DPPH-HPLC-DAD analysis on nine cultivars of introduced rabbiteye blueberry in China[J].Food Chemistry，2012（132）：759～765.

[5] Andrea Bunea，Dumitrita Rugina，Zorita Sconta，et al.Analysis anAnthocyanin determination in blueberry extracts from various cultivars and their antiproliferative and apoptotic properties in B16-F10 metastatic murine melanoma cells[J].Phytochemistry，2013（95）：436～444.

[6] Tao Wu，Xueming Qi，Yan Liu，et al.Dietary supplementation with purified mulberry （Morus australis Poir） anthocyanins suppresses body weight gain in high-fat diet fed C57BL/6 mice[J].Food Chemistry，2013（141）：482～487.

[7] Xiaolan Yang，Lei Yang，et al.Hypolipidemic and antioxidant effects of mulberry （Morus alba L.） fruit in hyperlipidaemia rats[J].Food and Chemical Toxicology，2010（48）：2374～2379.

[8] María J.Aguirre，Yo Y.Chen，Mauricio Isaacs，et al.Electrochemical behaviour and antioxidant capacity of anthocyanins from Chilean red wine，grape and raspberry[J].Food Chemistry，2010（121）：44～48.

[9] Wu X，Beecher GR，Holden J M，et al.Concentrations of anthocyanins in common foods in the United States and estimationof normal consumption[J].J Agric Food Chem，2006，54（11）：4069～4075.endprint

圖2高、低濃度下各段的抗氧化活性

4.3總花青素含量

從表2中可知，園藍(lán)鮮果甲醇提取物浸膏中花青素的百分含量為3669%，鮮果中總花青素平均含量為6277mg/100g。用相同的方法測(cè)得園藍(lán)凍干果中總花青素含量為4709g/100g。園藍(lán)鮮果花色苷中化合物1含量最高為1268mg/100g。

5結(jié)語(yǔ)

園藍(lán)提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性：非花青素部分在高濃度的情況下具有較好的抗氧化活性，而花青素部分在低濃度的情況下就能達(dá)到與高濃度時(shí)相當(dāng)?shù)目寡趸钚裕遗cVc的清除自由基的能力相當(dāng)，都說(shuō)明園藍(lán)花青素具有很好的抗氧化活性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還表明園藍(lán)花青素中，主成分為錦葵色素-3-O-葡萄糖。對(duì)其花青素含量進(jìn)行測(cè)定，不僅能為花青素的綜合利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，還可以指導(dǎo)人們對(duì)藍(lán)莓花青素的日常使用，據(jù)報(bào)道每人每天攝入花青素量約為12.5mg[9]，以此推算如果是食用以上的品種的藍(lán)莓鮮果，每人每天食用約2g園藍(lán)鮮果即可滿足攝入花青素的要求。

表2園藍(lán)鮮果花青素含量分析表

樣品編號(hào)1Xj/（×10～4mg）1xt%1xi%119.94313.67610.6290219.90413.66110.6264319.92413.66910.6277花青素平均含量19.92413.66910.6277

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圖2高、低濃度下各段的抗氧化活性

4.3總花青素含量

從表2中可知，園藍(lán)鮮果甲醇提取物浸膏中花青素的百分含量為3669%，鮮果中總花青素平均含量為6277mg/100g。用相同的方法測(cè)得園藍(lán)凍干果中總花青素含量為4709g/100g。園藍(lán)鮮果花色苷中化合物1含量最高為1268mg/100g。

5結(jié)語(yǔ)

園藍(lán)提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性：非花青素部分在高濃度的情況下具有較好的抗氧化活性，而花青素部分在低濃度的情況下就能達(dá)到與高濃度時(shí)相當(dāng)?shù)目寡趸钚裕遗cVc的清除自由基的能力相當(dāng)，都說(shuō)明園藍(lán)花青素具有很好的抗氧化活性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還表明園藍(lán)花青素中，主成分為錦葵色素-3-O-葡萄糖。對(duì)其花青素含量進(jìn)行測(cè)定，不僅能為花青素的綜合利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，還可以指導(dǎo)人們對(duì)藍(lán)莓花青素的日常使用，據(jù)報(bào)道每人每天攝入花青素量約為12.5mg[9]，以此推算如果是食用以上的品種的藍(lán)莓鮮果，每人每天食用約2g園藍(lán)鮮果即可滿足攝入花青素的要求。

表2園藍(lán)鮮果花青素含量分析表

樣品編號(hào)1Xj/（×10～4mg）1xt%1xi%119.94313.67610.6290219.90413.66110.6264319.92413.66910.6277花青素平均含量19.92413.66910.6277

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