轉(zhuǎn)OsEBP—89基因水稻芽期與幼苗期的抗鹽性鑒定

先友成進(jìn)　殷有偉　馮夢詩　張炳為　張昌泉　于恒秀

摘 要：以100 mmol濃度NaCl鹽脅迫，對(duì)轉(zhuǎn)OsEBP-89基因水稻T6代3個(gè)株系芽期與幼苗期抗鹽性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)OsEBP-89基因株系之間抗鹽性存在差異，其中兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（3448和3463）發(fā)芽勢比對(duì)照日本晴高，芽期綜合相對(duì)鹽害率顯著低于對(duì)照日本晴，說明轉(zhuǎn)基因材料在100 mmol NaCl脅迫下其芽受到鹽的傷害少于對(duì)照材料；但其發(fā)芽率、根長、苗高和幼苗期綜合相對(duì)鹽害率與對(duì)照日本晴沒有顯著差異。

關(guān)鍵詞：水稻；OsEBP-89基因；抗鹽性；芽期；幼苗期

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.001

Salt Tolerance of OsEBP-89 Transgenic Rice in Germination Period and Early Seedling Stage

SONU Songjin1，2， YIN You-wei1， FENG Meng-shi1， ZHANG Bing-wei1， ZHANG Chang-quan1， YU Heng-xiu1

（1.Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops， Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009， China； 2. Kim Il Sung University Pyongyang Agricultural Campus， Pyongyang， DPR of Korea）

Abstract： The salt tolerance of OsEBP-89 transgenic rice in the germination period and early seedling stage was studied in the condition of 100 mmol NaCl concentration. The results showed that the germination vigor of the two transgenic lines （3448 and 3463） was higher than the wild-type. The relative salt damage rate of these two transgenic lines in germinating period is lower than the contrast. But there is no significant difference in germination rate， root length and seedling height and relative salt damage rate of early seedling stage between transgenic lines and the wild-type.

Key words： rice； OsEBP-89 gene；salt tolerance；germination period；seedling stage

鹽害是世界上最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一。全球20%的耕地和近半數(shù)的灌溉土地都受到不同程度的鹽害威脅。水稻屬于不抗鹽植物， 土壤的鹽害影響使其產(chǎn)量難以提高[1-3]。因此， 對(duì)水稻抗鹽性的研究與改良非常重要。提高水稻抗鹽能力的方法主要是培育抗鹽品種， 而基因工程技術(shù)是快速實(shí)現(xiàn)這一目的的有力工具[4-6]。OsEBP-89基因是水稻中一個(gè)EREBP（Ethylene responsive elements binding protein）類轉(zhuǎn)錄因子[7-8]。AP2/EERBP轉(zhuǎn)錄因子在花發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程中起重要作用。根據(jù)該家族基因所含的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的數(shù)目不同可將其分為兩類：AP2和EREBP亞家族[9]。AP2亞家族含有兩個(gè)正向重復(fù)的AP2結(jié)構(gòu)域，主要調(diào)控細(xì)胞的生長發(fā)育；EREBP 亞族含有一個(gè)AP2-DNA結(jié)合域，主要調(diào)節(jié)植物對(duì)激素、病原、逆境等的響應(yīng)。許多外界條件，如乙烯、鹽、傷害、低溫和干旱等能誘導(dǎo)EREBP亞類家族基因的表達(dá)，使植物抗性和耐性提高[9-10]。已有的研究表明OsEBP-89基因參與了乙烯調(diào)控的水稻脅迫反應(yīng)和種子成熟過程，該基因的表達(dá)受激素及其類似物ACC、2，4-D、ABA、BR、JA、GA 和6-BA 的誘導(dǎo)，此外也受鹽脅迫的誘導(dǎo)[8，11-12]。用 NaCl 處理，OsEBP-89基因的表達(dá)在處理2 h 后有所升高，此后稍有變化[11]。但是關(guān)于轉(zhuǎn)OsEBP-89基因水稻幼苗抗鹽性研究還沒有報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)轉(zhuǎn)OsEBP-89基因水稻T6代種子進(jìn)行鹽脅迫下的發(fā)芽試驗(yàn)，研究其芽期及幼苗期的抗鹽能力，為進(jìn)一步研究OsEBP-89基因與水稻抗逆的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)用了3個(gè)轉(zhuǎn)OsEBP-89基因水稻株系3448，3463和3464及其受體親本日本晴。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)育水稻純系的分子鑒定 從同一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系來源的不同個(gè)體后代中各選擇16個(gè)單株，按CTAB法提取葉片總DNA。然后用PCR的方法鑒定純合轉(zhuǎn)基因水稻。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系鑒定的PCR擴(kuò)增的5和3端引物分別為與OsEBP-89基因片段編碼區(qū)和Ubi啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)，分別為BP89（5-GGGGACGACACACATGACAC-3）和 Ubi-F3（5-CTGATG CATATACATGATGG-3）。PCR產(chǎn)物大小為520 bp，反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min； 95 ℃，35 s；55 ℃，35 s；72 ℃，35 s；循環(huán)35 次；72 ℃，8 min。在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，通過紫外照射儀觀察結(jié)果。

1.2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn) 每份材料挑選50 粒飽滿的種子， 置于墊有濾紙的口徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中。先用3%的次氯酸鈉溶液處理， 消毒20 min， 然后用自來水沖洗6次。NaCl（分析純）脅迫濃度設(shè)0（ 蒸餾水） ，100 mmol兩個(gè)水平。發(fā)芽期和幼苗期調(diào)查性狀包括發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根數(shù)、根長和苗高。在培養(yǎng)皿里分別加入上述2個(gè)處理溶液10 mL，加蓋后放入28 ℃ 恒溫光照箱中催芽。鹽脅迫處理后的第3 天和第7天，以水稻種子的芽長和根長等于2 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[13] ， 分別調(diào)查種子的發(fā)芽粒數(shù)， 并計(jì)算發(fā)芽勢和發(fā)芽率及其相對(duì)鹽害率。然后， 將裝有發(fā)芽水稻種子的培養(yǎng)皿放置于溫度為28 ℃ 的恒溫的光照箱環(huán)境， 再繼續(xù)生長3 d后每個(gè)處理隨機(jī)選取10 株， 測量其根數(shù)、根長和苗高，并計(jì)算相應(yīng)的相對(duì)鹽害率。在恒溫箱內(nèi)催芽和幼苗生長期間， 每天定時(shí)更換一次鹽液。試驗(yàn)重復(fù)3 次。以相對(duì)鹽害率的大小來評(píng)價(jià)水稻發(fā)芽期和幼苗期耐鹽性的強(qiáng)弱，相對(duì)鹽害率的計(jì)算方法如下。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2007及spss17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)OsEBP-89基因純合株系的分子檢測

為檢測轉(zhuǎn)基因株系是否為純系，從每一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系來源的后代中各選擇16個(gè)單株，按CTAB法提取葉片總DNA，然后分別利用PCR檢測目的基因。圖1 所示為3463株系中16個(gè)單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果，均能特異性擴(kuò)增出520 bp的目的片段，說明該株系為含有OsEBP-89基因的純合株系。3448和3464株系也有同樣的PCR擴(kuò)增結(jié)果，證明3448和3464株系也為轉(zhuǎn)OsEBP-89基因的純合株系。

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

在100 mmol NaCl處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照的芽期發(fā)芽勢和發(fā)芽率見表1，對(duì)發(fā)芽勢來說轉(zhuǎn)基因株系之間存在明顯的差異，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系3463和3448的發(fā)芽勢分別為78.5%和70.4%，明顯高于對(duì)照（3447）的41.5%。而另一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（3464）與對(duì)照的發(fā)芽勢之間沒有明顯的差異。但發(fā)芽率在轉(zhuǎn)基因水稻和未轉(zhuǎn)化對(duì)照間無顯著差異。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻及其對(duì)照幼苗期性狀表現(xiàn)

為進(jìn)一步研究OsEBP-89基因的表達(dá)對(duì)水稻幼苗生長的影響，測定了幼苗前期的相關(guān)性狀并進(jìn)行了比較，結(jié)果見表2。在100 mmol NaCl濃度條件下，轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照的根長與苗高之間不存在顯著差異，但對(duì)照日本晴的根數(shù)明顯多于轉(zhuǎn)基因水稻。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照的芽期及幼苗期綜合相對(duì)鹽害率的比較

對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及其對(duì)照芽期及幼苗期綜合相對(duì)鹽害率進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。3448株系和3463株系的芽期綜合相對(duì)鹽害率分別為35.9%和34.9%，低于對(duì)照的52.0%，這說明在100 mmol NaCl 脅迫條件下，芽期轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽能力高于對(duì)照。轉(zhuǎn)基因株系的幼苗期綜合相對(duì)鹽害率與對(duì)照無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

本研究在100 mmol NaCl濃度脅迫條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)OsEBP-89基因株系及對(duì)照材料的發(fā)芽試驗(yàn)，測定不同材料的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根數(shù)、根長及苗高，并計(jì)算其芽期與幼苗前期綜合相對(duì)鹽害率。結(jié)論如下。

（1）芽期轉(zhuǎn)OsEBP-89基因株系之間抗鹽性存在差異，其中兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（3448和3463）發(fā)芽勢比對(duì)照日本晴高，芽期綜合相對(duì)鹽害率顯著低于對(duì)照日本晴，說明OsEBP-89基因的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)基因株系的芽期抗鹽性有關(guān)。

（2）幼苗期轉(zhuǎn)OsEBP-89基因株系的發(fā)芽率、根長、苗高和幼苗期綜合相對(duì)鹽害率與對(duì)照日本晴沒有顯著差異。

OsEBP-89基因是水稻中一個(gè)EREBP類轉(zhuǎn)錄因子。通過序列比較在OsEBP-89基因啟動(dòng)子區(qū)找到一個(gè)類似乙烯應(yīng)答元件（Ethylene responsive element， ERE），稱為IVC box。ERE元件是除了GCC box 和C/DRE box 外，又一個(gè)應(yīng)答乙烯信號(hào)的元件。ERE元件是在與果實(shí)成熟相關(guān)的基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的，它能夠應(yīng)答乙烯，促進(jìn)果實(shí)的成熟。在OsEBP-89基因啟動(dòng)區(qū)還存在可能參與乙烯應(yīng)答的另一個(gè)C/DRE元件[11]。C/DRE元件是與抗脅迫相關(guān)的元件。與DRE （Dehydration responsive element）順式元件特異性結(jié)合的DREB（Dehydration responsive element binding）轉(zhuǎn)錄因子，也是EREBP類轉(zhuǎn)錄因子。DREB是植物中特有的與低溫、高鹽和干旱脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子， 可以調(diào)控啟動(dòng)子中含有DRE元件的一類逆境響應(yīng)基因的表達(dá)[14-15]。Northern雜交也確實(shí)檢測出OsEBP-89基因的表達(dá)受激素及其類似物ACC、2，4-D、ABA、BR、JA、GA 和6-BA 的誘導(dǎo)，此外也受鹽脅迫的誘導(dǎo)[11-12]。陳芬等[16]對(duì)兩系雜交水稻不育系4008S的轉(zhuǎn)DREB 1A基因株系與非轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)照品種進(jìn)行了干旱脅迫處理，證明DREB1A 基因可以提高水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性。包永霞等[17]的研究結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)DREB1A基因可以明顯提高多年生黑麥草萌發(fā)期的耐鹽性。OsEBP-89基因和DREB類基因都受鹽脅迫的誘導(dǎo)，但OsEBP-89基因還受很多激素及其類似物的誘導(dǎo)，參與了很多方面的調(diào)控。因此，可能是OsEBP-89參與鹽脅迫的一些關(guān)鍵代謝過程的特異性比較低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)OsEBP-89基因水稻抗鹽性表現(xiàn)的時(shí)間比較早而短。

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