腫瘤相關巨噬細胞對皮膚惡性黑素瘤細胞A375生物學行為的影響

殷芳 吳飛 陳佳 章楚光 宋寧靜

腫瘤相關巨噬細胞對皮膚惡性黑素瘤細胞A375生物學行為的影響

殷芳 吳飛 陳佳 章楚光 宋寧靜

目的探討腫瘤相關巨噬細胞對皮膚惡性黑素瘤細胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法取對數生長期人單核細胞株U937，采用佛波酯誘導48 h后，分為3組，Mφ組(繼續用佛波酯誘導48 h)、M1組(用25 mg/L LPS誘導48 h)、M2組(用15 μg/L IL-4誘導48 h)。酶聯免疫吸附試驗檢測各組巨噬細胞上清中IL-12p70和IL-10表達水平。建立巨噬細胞與惡性黑素瘤A375細胞體外共培養體系，分別設單獨培養組、Mφ組(A375細胞和Mφ巨噬細胞共培養)、M1組(A375細胞和M1型巨噬細胞共培養)、M2組(A375細胞和M2型巨噬細胞共培養)，分別運用噻唑藍法、Transwell小室法觀察不同激活途徑的巨噬細胞對A375細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為的影響。結果增殖實驗顯示，共培養48、72 h后Mφ巨噬細胞、M2型巨噬細胞顯著促進A375細胞的增殖，M1型巨噬細胞抑制A375細胞的增殖，各處理組間兩兩比較，差異有統計學意義(均P＜0.05)，共培養24 h后各組間兩兩比較A375細胞增殖率差異無統計學意義(P＞0.05)。侵襲實驗顯示M2組和Mφ組穿過Transwell膜的A375細胞數量(147.00±7.92、113.22±8.15)較單獨培養組(84.11±6.07)明顯增加(P＜0.05)，M1組穿膜細胞(56.44±7.55)明顯減少(P＜0.05)。遷移實驗顯示M2組和Mφ組穿過Transwell膜的A375細胞數量(198.33±8.22、156.00±8.83)較單獨培養組(123.89±7.01)明顯增加(均P＜0.05)，M1組穿膜細胞(97.11±6.75)明顯減少(P＜0.05)。結論IL-4激活的M2型巨噬細胞對A375細胞的增殖、侵襲和遷移可能起促進作用；脂多糖激活的M1型巨噬細胞對A375細胞的增殖、侵襲和遷移可能起抑制作用。佛波酯誘導的巨噬細胞更傾向于M2型巨噬細胞表型。

黑色素瘤；細胞系，腫瘤；巨噬細胞；細胞增殖；細胞運動

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)是指浸潤于腫瘤間質中的巨噬細胞，是多數實體腫瘤組織中數量最多的炎癥細胞群，與腫瘤的發生發展關系密切。目前研究認為，TAM可以影響腫瘤發生的各個環節，促進血管生成、細胞增殖、組織重塑，抑制腫瘤免疫應答，導致腫瘤的發展和轉移[1]。有報道指出，TAM對黑素瘤的生長、血管生成、遠處侵襲和轉移具有重要作用[2]。然而，TAM對人惡性黑素瘤細胞侵襲進展的作用和影響目前尚不明確。本研究通過Transwell小室建立不同途徑激活的巨噬細胞與人惡性黑素瘤細胞的體外共培養體系，觀察巨噬細胞對人惡性黑素瘤細胞增殖、侵襲和遷移的影響。

材料與方法

1.材料:人單核細胞株U937購自美國菌種保藏中心(ATCC)。人惡性黑素瘤細胞A375購于中國科學院上海細胞庫。RPMI1640培養基、胎牛血清購于美國Hyclone公司，青鏈霉素雙抗液及0.25%胰酶購于美國Gibco公司，佛波酯、細菌脂多糖(LPS)、噻唑藍(MTT)粉末購于美國Sigma公司，重組人白細胞介素4(IL-4)購于美國Perprotech公司，人IL-10、IL-12p70 ELISA試劑盒購于美國RD公司、matrigel基質膠購于美國 BD 公司，0.4 μm、8 μm 濾膜孔徑的Transwell小室購于丹麥Nunk公司，細胞固定液、細胞穿膜液購于美國Biolegend公司。

2.細胞培養:人惡性黑素瘤細胞A375、人單核細胞株U937，均用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，在37℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養。

3.巨噬細胞的誘導:取對數生長期的人單核細胞株U937細胞，以1×106/孔接種于6孔板，加入佛波酯50 μg/L，孵育48 h，誘導形成巨噬細胞。

4.M1型、M2型巨噬細胞的誘導活化:將佛波酯誘導48 h后的巨噬細胞分成3組，Mφ組、M1組、M2組；用滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次，M1組、M2組分別加入含 LPS(25 mg/L)、IL-4(15 μg/L)的RPMI1640培養基(含10%胎牛血清)，孵育48 h，誘導成為M1型、M2型巨噬細胞。Mφ組則繼續加入含佛波酯50 μg/L的RPMI1640完全培養基。

5.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-12p70、IL-10表達水平:分別收集Mφ組、M1組、M2組細胞培養上清液離心，收集上清。按照ELISA試劑說明書進行操作，用酶標儀在450 nm處測定吸光度A值，檢測IL-12p70、IL-10表達水平。

6.A375細胞與巨噬細胞非接觸式共培養體系的建立:A375細胞胰酶消化，以1×105/ml的濃度重懸，取3塊共培養板，按500 μl/孔種于24孔Transwell培養板(濾膜孔徑0.4 μm)下層小室中孵育24 h；將不同激活途徑的巨噬細胞消化后分別收集，以5×105/ml的濃度按200 μl/孔種于上層小室。分別設單獨培養組、Mφ組(A375細胞和Mφ型巨噬細胞共培養)、M1組(A375細胞和M1型巨噬細胞共培養)、M2組(A375細胞和M2型巨噬細胞共培養)，共培養24、48、72 h后進行后續試驗。每組設4個復孔。

7.MTT法檢測A375細胞的增殖:共培養24、48、72 h后分別取出1塊培養板，在Transwell小室下室中加入MTT(5 g/L)，繼續孵育4 h，吸棄上清，加DMSO 400 μl/孔，振蕩10 min。在酶聯免疫測定儀上檢測各組490 nm處吸光度A值。計算細胞增殖率:增殖率(%)=(實驗組A值-單獨培養組A值/單獨培養組A值)×100%。每組設5個復孔。實驗重復3次。

8.Transwell小室檢測細胞侵襲能力:將Matrigel膠用無血清RPMI1640培養基1∶4稀釋，按60 μl/孔鋪于Transwell小室的上室面，37℃孵育過夜。所有操作均在冰上進行。每孔加入80 μl無血清1640培養基，37℃孵育30 min，吸去培養基；將共培養后的A375細胞用無血清培養基以5×106/ml濃度按200 μl/孔接種于上層小室，下層小室加入含10%胎牛血清的完全培養基500 μl，繼續培養24 h；吸盡培養基，PBS清洗3次，加入4%甲醛，室溫固定20 min，PBS清洗3次；風干后0.3%結晶紫染色20 min，PBS清洗3次；顯微鏡下觀察濾膜下表面藍紫色胞質細胞，隨機取10個×400視野分別計數，取均值。以穿膜細胞的數目表示細胞的侵襲能力。實驗重復3次。

9.Transwell小室檢測細胞遷移能力:實驗步驟同侵襲實驗，但不需鋪Matrigel膠。實驗重復3次。

圖1 U937細胞形態(×400) 1a:未誘導的U937細胞呈懸浮生長的葡萄串狀圓球形；1b:經佛波酯誘導24 h后部分細胞已貼壁(箭頭)；1c:經佛波酯誘導48 h后大部分細胞變為貼壁良好，且有偽足伸出，呈長梭形(箭頭)；1d:經佛波酯誘導72 h后細胞大量偽足伸出(箭頭)；1e:經佛波酯誘導96 h后細胞大量偽足伸出(箭頭)

結 果

1.佛波酯對單核細胞形態的影響:未經佛波酯誘導的人單核細胞株U937呈懸浮生長的葡萄串狀圓球形(圖1a)，經佛波酯誘導24 h后部分細胞已貼壁(圖1b)，48 h后大部分變為貼壁生長，貼壁良好，且有偽足伸出，呈長梭形，具備巨噬細胞形態(圖1c)。佛波酯繼續誘導48 h用于后續實驗(圖 1d，1e)。

2.經LPS及IL-4激活后的巨噬細胞分別高表達IL-12p70、IL-10:LPS激活后的巨噬細胞 IL-12p70分泌水平[(13.34±0.71)ng/L)]較佛波酯單獨誘導[(8.59±0.37)ng/L]及IL-4激活后的巨噬細胞[(7.15±0.78)ng/L]顯著提高；IL-4激活[(1 959.59±140.53)ng/L]及佛波酯單獨誘導[(1 352.25±151.08)ng/L]的巨噬細胞IL-10分泌水平較LPS激活的巨噬細胞[(186.13±21.03，ng/L]顯著提高；佛波酯誘導的巨噬細胞IL-12p70、IL-10的分泌水平與M2型巨噬細胞更為接近，也表現為高水平的IL-10、低水平的IL-12p70。

3.不同途徑激活的巨噬細胞對A375細胞增殖的影響:與A375細胞共培養24 h后，不同處理組間兩兩比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，但共培養48、72 h后各處理組間兩兩比較，差異均有統計學意義(均P＜0.05)。見表1。

4.不同途徑激活的巨噬細胞對A375細胞侵襲力的影響:M2型巨噬細胞組(147.00±7.92)和Mφ巨噬細胞組(13.22±8.15)穿過Transwell膜的A375細胞數量較單獨培養組明顯增加，M1型巨噬細胞組穿過Transwell膜的A375細胞數量較單獨培養組明顯減少，差異均有統計學意義(均P＜0.05)。

5.不同途徑激活的巨噬細胞對A375細胞遷移力的影響:M2組和Mφ組穿過Transwell膜的A375細胞數量較單獨培養組明顯增加，M1組較單獨培養組明顯減少，差異有統計學意義(均P＜0.05)。見表2。

討 論

表1 不同途徑激活的巨噬細胞對A375細胞增殖率的影響(%，±s)

表1 不同途徑激活的巨噬細胞對A375細胞增殖率的影響(%，±s)

注:n=3。Mφ組:A375細胞和佛波酯單獨誘導形成的Mφ型巨噬細胞共培養；M1組:A375細胞與佛波酯和LPS誘導形成的M1型巨噬細胞共培養，M2組:A375細胞與佛波酯和IL-4誘導形成的M2型巨噬細胞共培養。各處理組組內不同時間點兩兩比較差異有統計學意義(均P＜0.05)，各時間點不同處理組組間差異有統計學意義(均P＜0.05)

不同處理組 24 h 48 h 72 h Mφ組 11.88±3.60 16.85±3.36 20.98±0.87 M1組 -21.95±4.26 -36.58±1.87 -40.52±0.75 M2組 13.07±6.57 23.66±3.48 35.80±2.24

根據巨噬細胞激活途徑及激活后作用的不同將其分為兩類[3]:經干擾素γ(INF-γ)及細菌LPS等激活的巨噬細胞稱為經典激活的巨噬細胞(classical activated macrophage， caMφ 或 M1)，為一類“抑癌細胞”；經IL-4、IL-13等激活的巨噬細胞稱為替代激活的巨噬細胞(alternative activated macrophage，aaMφ或M2)，為一類“促癌細胞”。佛波酯誘導的人單核細胞系U937是巨噬細胞樣細胞，通常作為人巨噬細胞的模型，用于很多體外試驗[4]。研究證實，IL-12和IL-10的表達水平可用來區分M1型、M2型巨噬細胞，目前已被大量研究采用[5]。由LPS誘導激活的巨噬細胞表達高水平IL-12、低水平IL-10，表現為M1型巨噬細胞的表型[6]，而由IL-4誘導激活的巨噬細胞表達低水平IL-12、高水平IL-10，表現為M2型巨噬細胞的表型[7]。因而IL-12、IL-10的表達水平是區分M1型、M2型巨噬細胞的一個方法。

表2 不同激活途徑的巨噬細胞對A375細胞侵襲力和遷移力的影響(%，±s)

表2 不同激活途徑的巨噬細胞對A375細胞侵襲力和遷移力的影響(%，±s)

注:n=3。a:各組間兩兩比較差異均有統計學意義，均P＜0.01。Mφ組:A375細胞和佛波酯單獨誘導形成的Mφ型巨噬細胞共培養；M1組:A375細胞與佛波酯和脂多糖誘導形成的M1型巨噬細胞共培養；M2組:A375細胞與佛波酯和白細胞介素4誘導形成的M2型巨噬細胞共培養

處理組 穿膜細胞數(侵襲試驗) 穿膜細胞數(遷移試驗)單獨培養組 84.11±6.07 123.89±7.01 Mφ組 113.22±8.15 156.00±8.83 M1組 56.44±7.55 97.11±6.75 M2組 147.00±7.92 198.33±8.22 F值 243.85 284.69 P值 ＜0.01a ＜0.01a

我們在體外用佛波酯誘導單核細胞株U937成巨噬細胞；用LPS激活成M1型巨噬細胞，ELISA檢測顯示表達高水平的IL-12p70、低水平的IL-10；用IL-4激活成M2型巨噬細胞，ELISA檢測顯示其表達低水平IL-12p70、高水平IL-10。說明機體在疾病條件下，如腫瘤過程中可存在不同類型的巨噬細胞，這些不同類型的巨噬細胞發揮著不同的功能，可能對腫瘤的發生和發展起著不同的調節作用。另外，在實驗中我們還發現，佛波酯誘導的巨噬細胞IL-12p70、IL-10的分泌水平與M2型巨噬細胞更為接近，表現為高水平表達IL-10、低水平表達IL-12p70。

目前大多數觀點認為腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞即TAM主要表現為M2巨噬細胞表現型，是腫瘤組織中占優勢支配地位的巨噬細胞的表型，可通過細胞因子、趨化因子、生長因子、基質金屬蛋白酶的表達促進新生血管的生成、轉移，抑制適應性免疫[8]，發揮促癌作用，已在肝細胞癌、肺癌、乳腺癌中被證實[8-10]。

本實驗通過Transwell小室將不同途徑激活的巨噬細胞與人惡性黑素瘤A375細胞進行體外共培養，建立共培養體系，模擬惡性黑素瘤局部巨噬細胞浸潤微環境，觀察不同途徑激活的巨噬細胞對人惡性黑素瘤A375細胞增殖、侵襲和遷移的影響。我們發現:①IL-4激活的M2型巨噬細胞促進A375細胞的增殖、侵襲和遷移，LPS激活的M1型巨噬細胞抑制A375細胞的增殖、侵襲和遷移；②佛波酯誘導的Mφ巨噬細胞更傾向于M2型巨噬細胞的表型，對A375細胞的增殖、侵襲和遷移起促進作用。通過以上研究結果，我們可以進一步推測，人惡性黑素瘤組織中浸潤的巨噬細胞即TAM可能主要表現為M2巨噬細胞表現型，對腫瘤的發生和發展起一定的促進作用。

有研究發現，巨噬細胞可隨著在腫瘤微環境中所接觸到的細胞因子的不同(Th1或Th2細胞因子)，實現M1型向M2型或M2型向M1型巨噬細胞的轉化，從而對腫瘤起促進或抑制的不同作用[11]。有研究指出在腫瘤發病的開始階段主要是M1型巨噬細胞被激活，隨后M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞即TAM轉化[12]，促進腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移。我們推測:①TAM在皮膚惡性黑素瘤組織中可能主要是以替代激活的M2型巨噬細胞表型存在，對皮膚惡性黑素瘤的發生、發展、侵襲和轉移起促進作用，是導致其預后不佳的重要因素；②巨噬細胞的異質性和可塑性為我們有效治療皮膚惡性黑素瘤提供了一個可能的治療靶點，直接抑制腫瘤組織中巨噬細胞向M2型巨噬細胞即TAM轉化，通過相關途徑誘導TAM向M1型巨噬細胞轉化，有效地控制和治療皮膚惡性黑素瘤。究竟TAM如何對皮膚惡性黑素瘤細胞生物學行為產生影響，又有哪些可能的相關因素參與其作用過程，目前尚不清楚，值得進一步研究。

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2013-09-10)

(本文編輯:尚淑賢)

Effects of tumor-associated macrophages on the biological behavior of A375 human malignant melanoma cells

Yin Fang*，Wu Fei，Chen Jia，Zhang Chuguang，Song Ningjing.*Shanghai Skin Disease Hospital，Anhui Medical University，Shanghai 200443，China

Song Ningjing，Email：songnj-10@163.com

ObjectiveTo evaluate the effects of tumor-associated macrophages on the proliferation，invasion and migration of human cutaneous malignant melanoma cells.MethodsCultured U937 human monocytic cells at logarithmic phase were classified into three groups to be pretreated with phorbol ester for 48 hours followed by 48-hour activation by phorbol ester(Mφ polarization)，lipopolysaccharide(LPS)at 25 mg/L(M1 polarization)，and interleukin(IL)-4 at 15 μg/L(M2 polarization)respectively.Then，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the levels of IL-12p70 and IL-10 in the supernatant of these activated cells.A375 human malignant melanoma cells were divided into four groups to be cultured alone or with Mφ-，M1-and M2-polarized macrophages respectively.After additional culture for different durations(24，48 and 72 hours)，methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was conducted to estimate the proliferative activity，and Transwell assay to evaluate the invasion and migration activity，of the A375 cells.ResultsThe proliferation of A375 cells was accelerated by coculture with Mφ-and M2-polarized macrophages，but inhibited by that with M1-polarized macrophages，with significant differences among the four groups in the proliferative activity at 48 and 72 hours(allP＜0.05)，but not at 24 hours(P＞0.05).Invasion assay showed that the number of A375 cells that migrated through Transwell chambers was significantly larger in M2 and Mφ groups(147.00±7.92 and 113.22±8.15 respectively)，but smaller in the M1 group(56.44 ± 7.55)，than in the control group(84.11 ± 6.07，allP＜ 0.05).Similarly，migration assay revealed a significant increase in the number of A375 cells that migrated through Transwell chambers in the M2 and Mφ groups(198.33±8.22 and 156.00±8.83 respectively)，but a significant decrease in the M1 group(97.11±6.75)as compared with the control group(123.89±7.01，allP＜0.05).Conclusions The proliferation，invasion and migration of A375 cells can be accelerated by IL-4-activated M2-polarized macrophages，but decelerated by LPS-activated M1-polarized macrophages.Phorbol ester tends to induce monocytic cells to differentiate into M2-polarized macrophages.

Melanoma；Cell line，tumor；Macrophages；Cell proliferation；Cell movement

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.003

上海市自然科學基金(11ZR1432900)；上海市衛生局科研項目(20114125)

200443上海市皮膚病醫院(殷芳、陳佳、章楚光、宋寧靜)；安徽醫科大學上海皮膚病臨床學院(吳飛)

宋寧靜，Email:songnj-10@163.com