人乳頭瘤病毒型別及載量與尋常疣臨床特征相關性研究

張紅葉 郭宗科 董正邦 嚴翹 王飛

人乳頭瘤病毒型別及載量與尋常疣臨床特征相關性研究

張紅葉 郭宗科 董正邦 嚴翹 王飛

目的探討人乳頭瘤病毒型別、載量與尋常疣臨床特征的相關性。方法提取48例尋常疣組織DNA；正反向測序通用引物PCR擴增片段，通過blast比對分型，并通過型別特異性引物PCR來驗證和補充測序結果；實時熒光定量PCR相對定量ΔCt法檢測HPV病毒載量；HE染色法觀察病理變化。結果35例HPV PCR檢測陽性的標本中HPV 7型32例；HPV 57型1例，為四肢末端多發；HPV 2和HPV 7混合感染2例，為頭面部、軀干多發病例。單發組與多發組、病程＜6個月組與病程6個月至1年組病毒載量、空泡化細胞數目無明顯差異，1年后病毒載量有下降趨勢，病程＞2年的皮損，角化過度更明顯，空泡化細胞減少。結論尋常疣的HPV感染型別主要是HPV 7；HPV 7型感染好發于頭面部；對于病程1年內的尋常疣，HPV病毒載量及空泡化細胞數目與其數目、病程長短無明顯相關性。

人乳頭瘤病毒；疣；病毒載量；疾病特征

尋常疣是常見的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染皮膚黏膜引起的良性贅生物，其發病率高，可發生于身體任何部位，常好發于易受外傷部位，單發或多發，65%患者可在2年內自行消退[1]，部分則發展為巨大疣。尋常疣發病部位、單發與多發、病程長短與轉歸，病理變化，是否與感染的HPV特異性型別、病毒載量有關，目前研究不多。本研究通過通用引物PCR擴增后測序及型別特異性PCR檢測尋常疣中HPV型別，實時熒光定量PCR相對定量ΔCt法測定病毒載量水平，分析HPV型別及載量與尋常疣臨床表現及病理變化的相關性。

資料與方法

一、資料

1.病例資料:48例尋常疣皮損標本均來自東南大學附屬中大醫院皮膚性病科門診就診的典型的尋常疣患者，收集臨床資料，包括性別、年齡、病程、皮損部位、皮損特征、單發或多發及隨訪情況。其中男30例，女18例，平均(43.5±19.7)歲(12～89歲)；單發組30例，多發組18例；頭面部32例，四肢末端9例，軀干部9例；病程 ＜1年35例，病程 ≥1年13例，其中病程≥2年5例。6例正常包皮組織來自于東南大學附屬中大醫院泌尿外科就診的包皮過長的患者，包皮提供者均簽署知情同意書。同一患者同一部位的多發皮損，取一份標本；同一患者不同部位的多發皮損則分部位分別取材，一份用于型別載量的測定，一份用于病理檢查。尋常疣組織標本及包皮組織于-80℃保存。本研究通過本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

2.主要儀器和試劑:Eppendorf PCR基因擴增儀為德國Eppendorf公司產品，Gel Doc凝膠掃描成像系統為美國Bio-Rad公司產品，DY-A電泳儀為上海生化所西巴斯生物科技開發公司產品，HC-2518R高速冷凍離心機為合肥科大創新股份有限公司中佳分公司產品，電動組織研磨器為江蘇大地自動化儀器廠產品，蛋白酶K為美國Sigma公司產品，Takara熱啟動酶反應盒為大連Takara公司產品，標準DNA Marker為美國Axygen公司產品。

3.引物:內參引物PC03/05、通用引物MY09/11均參照文獻設計[2]，分別擴增人β珠蛋白209 bp、HPV L1 450 bp片段，PC03/05引物序列:上游引物5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'、下游引物5'-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3'；MY09/11 引物序列:上游引物5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'、下游引物5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'(混合堿基 M=A+C、R=A+G、W=A+T、Y=C+T)。根據文獻中尋常疣感染的常見型別，對標本DNA 進行 HPV 2、4、7、27、57這 5個 HPV 型別的型別特異性引物PCR(TSP-PCR)，以上各型型別特異性引物均有兩套，一套參照以往文獻設計[2-3]，命名為TSP舊；一套由杭州赫貝科技有限公司設計，命名為TSP新，各套型別特異性引物序列、擴增片段及產物大小見表1。

表1 型別特異性引物序列、擴增片段及產物大小

二、方法

1.組織標本DNA的提取:稱取約100 mg的組織，加入消化緩沖液，研磨至組織消失后加入蛋白酶k溫育消化；分別加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)及等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，17 000 ×g、4℃離心15 min提純，取上清；加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉溶液和2體積的無水乙醇，-20℃中靜置1 h后再同前離心30 min，棄上清；加70%乙醇振蕩洗滌，加入TE緩沖液，使終濃度為1 mg/ml，-20℃保存。提取的DNA液以PC03/05擴增人β珠蛋白，驗證提取模板質量。

2.HPV型別檢測:DNA提取液以MY09/11為通用引物擴增HPV L1片段，反應體系為:緩沖液5 μl，dNTP 4 μl， 上下游引物各 0.8 μl，Takara 熱啟動酶0.3 μl，DNA 模板 6 μl，加 dH2O 至總體積 50 μl；擴增條件:預變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s，退火53℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，再延伸72℃ 5 min，循環數35。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳出現450 bp陽性條帶的，擴增產物送華大基因公司處理，進行正反雙向測序，對測序序列進行拼接后在NCBI的blast上比對，判定HPV型別。同時，每份DNA提取液均以表1所示的5個特異性型別HPV的兩套引物系統作引物進行擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，判定是否為表1中的5個特異性型別。反應體系為: 緩沖液 2.5 μl，dNTP 2 μl， 上下游引物各0.4 μl，Takara 熱啟動酶 0.15 μl，DNA 模板 3 μl，加dH2O至總體積25 μl；擴增條件:預變性94℃2 min，變性94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，再延伸72℃ 5 min，循環數25。

3.HPV載量的實時熒光定量PCR檢測:將HPV 7型的DNA提取液以表1中TSP 7新為引物擴增，進行HPV 7型病毒載量實時熒光定量PCR檢測，由杭州赫貝科技有限公司完成，擴增條件:預變性95℃ 5 min，變性95℃ 25 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72℃ 35 s，循環數40。結果依據2-ΔCt計算。

4.組織病理檢查:疣體較大的尋常疣標本，將其一分為二，一半予4%甲醛固定后，進行HE染色，鏡下觀察，并對每個標本選取3個不同高倍鏡(×400)視野進行空泡化細胞數目計數，取平均值代表組織空泡化細胞數目水平。

5.統計學方法:用SSPS 17.0軟件進行統計學分析，對獲得的病毒載量、組織病理空泡化細胞數目等數據以±s表示，對符合正態分布的各組數據用獨立樣本t檢驗，檢驗水準選擇0.05。

結 果

一、HPV型別測定結果

48例尋常疣標本中，43例證實DNA提取成功；有5例提取失敗，且其中2例為病程超過2年患者。6例正常包皮組織均提取DNA成功。

圖1 通用引物MY09/11 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖 M:標準參照物；1～14:尋常疣組織標本；N:包皮組織標本

1.通用引物PCR測序分型結果:在DNA提取成功的43例中，35例均在450 bp處出現陽性條帶(圖1)；其中2例提取DNA成功的病程超過2年的病例，HPV通用引物PCR定性均陰性；6例正常包皮組織均未出現450 bp條帶。35例中1例為HPV 57型，為四肢末端、多發、病程12個月的病例；其余34例均為HPV 7型。

表2 型別特異性PCR分型結果(例)

圖2 尋常疣TSP-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖 2a:HPV 7感染；2b:HPV 2/7混合感染；2c:HPV 57感染。M:標準參照物；1～5:分別為同一尋常疣組織標本的TSP新 2、4、7、27、57擴增產物；1*～5*:分別為同一尋常疣組織標本的TSP舊 2、4、7、27、57擴增產物

2.型別特異性PCR分型結果:兩套引物的分型結果一致顯示，1例同通用引物PCR測序結果為HPV 57型，2例為HPV 2和HPV 7混合感染型，為頭面部、多發、病程＜1年病例，其中1例還合并有軀干部皮損；其余32例均為HPV 7型。具體分型結果見表2，圖2。

二、HPV載量測定結果

選取HPV 7型感染的單發組、多發組各8個樣本DNA進行實時熒光定量檢測HPV病毒載量，其中14例病程在1年以內，1例為12個月，1例為18個月，這兩例病毒載量均較其他病例明顯減少，2-ΔCt結果分別為1978.165、773.259。組間載量情況比較，單發組與多發組、病程＜6個月組與病程6個月至1年組病毒載量差異無統計學意義。見表3。

三、組織病理結果

選取單發組、多發組各9例的皮損行組織病理檢查，16例為HPV 7型感染、病程≤ 1年的病例，2例為提取DNA失敗、病程 ＞2年的病例。HE染色，病理顯示18例組織標本均表現典型的尋常疣組織病理改變，空泡化細胞計數:單發組與多發組、病程＜6個月組與病程6個月至1年組的空泡化細胞數目差異無統計學意義，P＞0.05(表4)；2例病程＞2年的空泡化細胞計數分別為19、22，比病程＜2年的角化過度更明顯，空泡化細胞減少。

討 論

表3 組間HPV載量情況比較(±s)

表3 組間HPV載量情況比較(±s)

組別 例數 載量2-ΔCt P值單發組 8 2189.77±853.06 ＞0.05多發組 8 2893.84±1093.18病程＜6個月組 9 2724.06±1067.07 ＞0.05 6個月至1年組 6 2531.00±656.11

表4 尋常疣組織病理空泡化細胞數目計數結果(±s)

表4 尋常疣組織病理空泡化細胞數目計數結果(±s)

組別 例數 空泡化細胞數目 P值單發組 9 42±15 ＞0.05多發組 9 41±10病程＜6個月組 8 44±13 ＞0.05 6個月至1年組 8 45±8

既往有關于尋常疣HPV型別的研究表明:在歐洲人群中尋常疣的感染型別主要是HPV2、27、57[4]，日本則為HPV1、4、65[5]，德國的主要流行型別是HPV1、2、4、10、27、57、65[6]。 在中國，Lei等[7]發現北京48例尋常疣標本HPV主要型別為 1、2、27、57。Chen等[8]發現中國臺灣61例尋常疣標本主要型別為 HPV 1、2、4、5。 通過檢測尋常疣的常見型別發現:HPV 4型可以導致病程的延長[9]；HPV 2與皮損形態有相關性[7]。感染HPV 2型的尋常疣更傾向于多發，皮損體積偏大，且對治療療效不好[10-11]；HPV 57有惡變傾向[12]，且多發生于掌跖部[13]。本實驗在測定HPV型別的方法選取上，考慮到對于有混合感染的標本，HPV擴增效率不一樣時或一種型別的HPV的量比另一種高很多，通用引物PCR可能使其中一型的產物占絕對優勢，這時測序法就無法分辨出另一種型別，造成假陰性，故用通用引物PCR測序分型，再通過型別特異性引物PCR驗證和補充通用引物PCR的測序結果。同時，本實驗在型別特異性PCR的引物選取中，每個型別都通過兩套引物系統擴增HPV不同的基因組區域進行驗證，提高了結果的準確性。本實驗中，型別特異性PCR檢測2例為HPV 2、HPV 7混合感染的病例，而通用引物PCR測序分型卻為HPV 7單一型別。

通過結合兩種方法的型別測定，本實驗中35例尋常疣HPV感染型別32例是HPV 7型，2例是HPV 2、HPV 7混合感染，1例是HPV 57型。32例HPV 7型尋常疣既有發生于四肢末端(11.1%)，也有發生于頭面部(72.2%)，及軀干部(16.6%)，說明其主要發生于頭面部，亦可發生于其他任何部位；這32例HPV 7感染患者也無職業特殊性，與皮損形態、單發或多發無特定關系。2例HPV 2型的感染，均為多發，且皮損形態都是菜花樣成簇分布，這2例同時感染有HPV 7型，HPV 2、7均屬于α-HPV，說明HPV 2型有合并同種屬其他HPV型別的混合感染的傾向。其中1例HPV 2/7的感染，為發生于面部、軀干及肛周的多發皮損，說明HPV 2、7可以發生于肛周生殖器部位。本實驗中只發現1例HPV 57感染，也是發生于手部的多發皮損，由于例數太少，無法確定其與尋常疣形態、數目的關聯性。

由于PCR基因分型結果大部分尋常疣是HPV 7感染，故本實驗中僅測定了HPV7型尋常疣的病毒載量，發現HPV 7型病毒載量與疾病的單發、多發無明顯相關，與1年以內的病程長短亦無明顯相關。本實驗中觀察到空泡化細胞數目多少與疾病的單發、多發及1年以內的病程長短無明顯相關，而2例病程＞2年的皮損出現相對于病程＜2年的角化過度更明顯，空泡化細胞減少的現象。而空泡化細胞是HPV病毒活力的象征[14]，空泡化細胞減少預示病毒對宿主細胞的致病性減弱，從而可以解釋尋常疣可自行消退的臨床表現。但此推論還需更多病程時間長的尋常疣組織標本的病理檢查來進一步驗證。

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2014-01-01)

(本文編輯:吳曉初)

Association analysis between human papillomavirus genotypes and viral load and clinical featuresof verruca vulgaris

Zhang Hongye*，Guo Zongke，Dong Zhengbang，Yan Qiao，Wang Fei.*Department of Dermatology，Nanjing Children's Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210008，China

Wang Fei，Email：ffwangfei@163.com

ObjectiveTo study the association between human papillomavirus(HPV)genotypes and viral load and clinical features of verruca vulgaris.MethodsTissue samples were collected from 48 outpatients with verruca vulgaris，and DNA was extracted from these tissue samples.To determine the genotype of HPV，PCR was performed to amplify the L1 fragment of HPV with universal primers followed by bidirectional sequencing and BLAST.The genotyping results were validated by PCR with type-specific primers.Real-time fluorescence-based quantitative PCR was conducted to measure the viral load of HPV，and hematoxylin and eosin(HE)staining to observe histological changes in these tissue specimens.ResultsThe L1 fragment of HPV was amplified from 35 out of the 48 tissue specimens.Of the 35 L1-positive specimens，32 harbored HPV 7，1 harbored HPV 57，and 2 harbored both HPV 2 and HPV 7.Multiple lesions were observed on extremities in the patient infected with HPV 57，but on the head，face and trunk in the patients coinfected with HPV 2 and HPV 7.There were no significant differences in HPV viral load or vacuolated cell number between patients with single lesions and those with multiple lesions，or between patients with a clinical course of＜ 6 months and those with a clinical course of 6-12 months.However，HPV viral load tended to decrease one year after the onset，and there was pronounced hyperkeratosis and less vacuolated cells in lesions of long duration(more than 2 years)compared with those of short duration(less than 2 years).Conclusions HPV 7 appears to be the most common HPV genotype associated with verruca vulgaris，and HPV 7 infection usually occurs on the head and face.For verruca vulgaris of less than 1 year，neither HPV viral load nor vacuolated cell number is associated with the count or clinical course of warts.

Human papillomavirus；Warts；Viral load；Disease attributes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.006

江蘇省自然科學基金面上研究項目(BK2012748)；南京市科技發展項目(201104028)

210008南京醫科大學附屬南京兒童醫院皮膚科(張紅葉)；東南大學附屬中大醫院燒傷整形外科(郭宗科)，皮膚科(董正邦、嚴翹、王飛)

王飛，Email:ffwangfei@163.com