皮膚感染性肉芽腫常見病原菌微孔板反向雜交檢測法的研究

閆楨楨 姜海琴 孫建方 沈永年 崔盤根 劉偉軍 王洪生 劉維達

皮膚感染性肉芽腫常見病原菌微孔板反向雜交檢測法的研究

閆楨楨 姜海琴 孫建方 沈永年 崔盤根 劉偉軍 王洪生 劉維達

目的探討微孔板反向分子雜交技術與PCR-ELISA相結合的“擬芯片”法檢測和鑒定皮膚感染性肉芽腫常見病原菌的方法。方法選取、設計真菌和分枝桿菌兩對通用引物，及10種皮膚感染性肉芽腫常見的病原菌:結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、海魚分枝桿菌、偶遇分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、申克抱子絲菌、卡氏枝抱霉、裴氏著色真菌、F.Monophora、白念珠菌的特異性探針；采用標準株驗證通用引物、特異性探針并檢測“擬芯片”法的敏感性、特異性；對19株臨床分離株進行檢測和鑒定。結果兩對通用引物均可擴增出對應的菌種基因序列，PCR產物經測序分析與預期相符；“擬芯片”法檢測陰性標本吸光度為0.041±0.02，公式計算得臨界值為0.101，在此基礎上測得其敏感性為1×10～1×102個菌細胞/ml。各病原菌與相應的探針雜交，吸光度均＞0.101，為陽性；而與非對應的探針雜交，則吸光度＜0.101，為陰性，特異性高；對臨床分離株的菌種鑒定準確率高。結論“擬芯片”法可應用于皮膚感染性肉芽腫常見病原菌的實驗室快速檢測和鑒定。

肉芽腫；分枝桿菌感染；真菌感染；寡核苷酸反向雜交技術

皮膚感染性肉芽腫病是一組主要由真菌、分枝桿菌以及寄生蟲等病原體所致的、組織病理呈肉芽腫改變且臨床表現相似的疾病。該組疾病的主要致病菌是真菌和分枝桿菌，如結核桿菌、麻風桿菌、非結核分枝桿菌和暗色真菌、抱子絲菌等，此類病原菌不僅能引起皮膚感染，還可通過血行播散或直接浸潤擴散導致系統感染。我們在既往建立的“擬芯片”方法基礎上，設計并整合針對該組疾病常見病原體培養物的實驗室初步快速鑒定的方法，以期對皮膚感染性肉芽腫的臨床早期快速診斷。

資料和方法

一、菌株來源及培養

標準株及來源:分枝桿菌標準株，包括結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、海魚分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌和偶遇分枝桿菌為我所分枝桿菌實驗室保存株(引自于法國巴斯德研究所)；真菌標準株(白念珠菌[CMCCC(F).C1a]、申克抱子絲菌[CMCCC(F).D1a]、裴氏著色真菌[CMCCC(F).D6i]、F.monophora[CMCCC(F).D6h]、卡氏枝抱霉菌[CMCCC(F).D10a])由中國微生物菌種保藏管理委員會醫學真菌中心提供。臨床株共19株分離自我所門診臨床患者，19例患者的皮損組織病理呈肉芽腫改變，同時相關病原體已被明確鑒定。各標準株及臨床株傳代:分枝桿菌及真菌標準株分別接種于改良羅氏培養基和PDA培養基斜面，根據其最適生長溫度分別置于32℃、37℃、28℃培養。麻風分枝桿菌采取小鼠足墊接種法進行傳代及保藏。

二、主要儀器和設備

酶標儀、高速離心機購于美國Thermo Scientific公司，凝膠成像系統購于美國Bio-Rad公司，水平電泳儀和電泳槽購于日本Advance公司。GeneAmp 9700 PCR儀購于美國ABI公司。可拆卸96孔DNA雜交板購于美國Corning Costar公司，ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM試劑盒購于美國Zymo research公司。

三、方法

(一)引物、探針的設計:

1.引物:根據分枝桿菌16SrRNA DNA的保守序列區設計引物，真菌采用通用引物ITS1、ITS2，其中上游引物的5'端均標記生物素，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成并標記。分枝桿菌上游引物:5'-生物素-GAGATACTCGAGTGGCGAAC-3'，下游引物:5'-GGCCGGCTACCCGTGGTC-3'；真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAAACCTGCGG-3')和ITS2(5'-生物素GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3')。

2.探針:根據分枝桿菌16SrRNA的保守序列區及真菌 rDNA-ITS區設計探針(http：//www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)，其中在探針的5'端進行氨基化學修飾，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成并修飾。5種分枝桿菌16SrRNA DNA探針序列分別是(5'-3'):結核分枝桿菌ACCACAA GACATGCATCCCG，麻風分枝桿菌AAGACATGCG CCTTGAAG，海魚分枝桿菌CGGGATTCATGTCCTG TGGTGGAA，膿腫分枝桿菌 AGGACCACACACTTC ATGGTGAGT，偶遇分枝桿菌ACCACACACCATGAA GCGCG。5種真菌rDNA-ITS區探針序列分別是(5'-3'):白念珠菌 AACAAACTTGCTTTGGCGGT，申克抱子絲菌CCCAATCTCGTTCTCGTTGC，裴氏著色真菌/F.Monophora TAGACCTCAGTTGCTTCGGC，卡氏枝抱霉TCCGCCGAAGCAACATGAGG。

(二)菌株DNA模板制備及擴增:

1.配制各標準株純菌懸液，同時梯度稀釋至1×105～1×10個菌細胞/ml；采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存備用。

2.PCR反應體系及PCR循環條件:反應總體積為 50 μl，含 25 μl GoTaq Green Master Mix(2 × 反應緩沖液，dATP、dAGP、dCTP、dTTP 均 400 μmol/L，MgCl23 mmol/L)，引物各 1 μl，DNA 模板 2 μl，補超純水至 50 μl。95 ℃ 5 min預變性后，95 ℃ 30 s，55 ℃20 s，72℃ 30 s，共進行35個循環，最后72℃延伸5 min。擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，每個加樣孔點樣6 μl，電泳緩沖液為1×TAE，恒壓180 V，電泳約20 min。電泳結束后，取瓊脂糖凝膠在凝膠成像儀上紫外線透射下觀察結果并攝片。同時取擴增產物送南京思普金生物科技有限公司進行測序分析。

(三)病原菌株“擬芯片”法檢測步驟:

1.探針的包被:用探針溶液(NaCl 1.5 mol/L、Tris-HCl 0.3 mol/L、MgCl20.3 mol/L，pH 8.0)將探針溶解，濃度為探針液含探針100 pmol/100 μl；取100 μl探針液加入96孔微孔板中；將微孔板放置37℃下30 min。

2.探針包被后微孔板的清洗和封閉見文獻[1]。

3.微孔板反向分子雜交:取不同濃度的菌株DNA PCR產物25 μl，95℃加熱變性5 min后立即放入冰水浴中10 min，加入75 μl雜交液混勻；取100 μl已變性的PCR產物，分別加入已包被有探針的微孔板中，55℃雜交45 min；用雜交洗液清洗微孔板3次，拍干；每孔加200 μl封閉液室溫下封閉15 min。

4.酶顯色反應及其檢測:每孔加100 μl辣根過氧化物酶標記的親和素，37℃反應30 min；余步驟見文獻[1]。包括結核分枝桿菌、偶遇分枝桿菌在內[2]，10種皮膚感染性肉芽腫病原菌探針均經上述步驟進行驗證。

(四)皮膚感染性肉芽腫常見病原菌“擬芯片”法臨界值的確定:取20份培養及PCR瓊脂糖凝膠電泳結果都為陰性的疑似皮膚感染性肉芽腫的標本，采用試劑盒法提取DNA后進行PCR微孔板反向分子雜交ELISA檢測，計算吸光度的x ± s。

(五)皮膚感染性肉芽腫常見病原菌“擬芯片”法的敏感性和特異性檢測:采用上述10種病原菌標準株純菌懸液梯度稀釋的不同濃度所提取DNA的PCR擴增產物，進行微孔板反向雜交，確定“擬芯片”法的敏感性。對10種菌株相應的探針進行特異性檢測:DNA雜交板上固定包被10種菌株探針及陰性對照，選擇10種病原菌標準株PCR擴增產物與之雜交。實驗重復3次，取平均值。

用上述“擬芯片”法對確診的臨床皮膚感染性肉芽腫標本培養物/小鼠傳代菌株進行檢測。

結 果

一、10種皮膚感染性肉芽腫病原菌DNA的PCR擴增

用分別針對分枝桿菌16SrRNA DNA的引物及真菌rDNA-ITS區通用引物對10種病原菌標準株的DNA進行PCR擴增后，可見到清晰條帶。見圖1。將測序所得DNA片段在基因庫中進行BLAST比對分析，驗證通用引物可用。

二、分枝桿菌“擬芯片”法臨界值的確定

三、皮膚感染性肉芽腫病原菌10種探針“擬芯片”法的敏感性檢測

皮膚感染性肉芽腫病原菌10種探針(探針的包被濃度為100 pmol/μl)“擬芯片”法檢測結果顯示該方法同PCR-瓊脂糖凝膠電泳敏感性基本一致。結果見表1，圖1。

四、皮膚感染性肉芽腫病原菌10種探針“擬芯片”法的特異性檢測

10種標準株菌懸液濃度皆為1×103菌細胞/ml，各病原菌與相應的探針雜交，吸光度均＞0.101(臨界值)，為陽性；而與非對應的探針雜交，則吸光度＜ 0.101，為陰性。

五、感染性肉芽腫皮膚標本分離菌的檢測

圖1 10種病原菌不同菌懸液濃度DNA進行PCR擴增的敏感性檢測結果(PCR產物片段為200～300 bp) 1a:M:標準參照物；1:陰性對照；2～6:結核分枝桿菌，純菌懸液濃度依次為1×105菌細胞/ml～1×10菌細胞/ml；7～11:麻風分枝桿菌。1b:M:標準參照物；1～5:膿腫分枝桿菌；6～10:偶遇分枝桿菌。1c:M:標準參照物；1～5:海魚分枝桿菌。1d:M:標準參照物；1～5:白念珠菌；6:陰性對照；7～11:申克抱子絲菌。1e:M:標準參照物；1～5:卡氏枝抱霉；6～10:F.monophora。1f:M:標準參照物；1～5:裴氏著色真菌

對19個通過培養獲得的臨床標本菌株用“擬芯片”法進行鑒定，其中麻風分枝桿菌取自小鼠足墊。結果顯示結核、麻風、海魚分枝桿菌各3株，偶遇1株，膿腫1株，申克抱子絲菌2株，白念珠菌2株，卡氏枝抱霉1株，裴氏著色真菌1株，F.Monophora2株。同測序比對分析結果吻合。

表1 皮膚感染性肉芽腫10種探針“擬芯片”法的敏感性檢測結果

討 論

皮膚感染性肉芽腫臨床表現多形性，缺乏特異性，其組織病理的呈感染性肉芽腫改變，導致臨床診斷極為困難。分子診斷的研究多數針對單一菌種(屬)[3-7]，尚少見針對“皮膚感染性肉芽腫”這一組疾病的病原體同時進行相關檢測的研究[8]。我們通過查閱文獻，篩選出國內皮膚感染性肉芽腫病最常見的病原菌[9]:申克抱子絲菌、卡氏枝抱霉、裴氏著色真菌、F.Monophora(本實驗中真菌除常見的皮膚深部感染性肉芽腫病原菌外，加入深部感染最常見的白念珠菌)、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、海魚分枝桿菌、偶遇分枝桿菌及膿腫分枝桿菌。所篩選出的真菌和分枝桿菌各5種菌種所致感染病例報道總數占各自組內所有報道的感染菌種總數的90%以上。通過設計各菌種的特異性探針，初步建立了“擬芯片”法對皮膚感染性肉芽腫的快速初篩診斷。

本實驗所采用的微孔板反向雜交技術是基于既往已經建立的皮膚分枝桿菌“擬芯片”檢測法所形成，其特點如下:易于操作，整個過程約4 h；陽性結果通過顯色反應客觀可見；所需設備試劑相對簡化安全，避免了PCR瓊脂糖凝膠檢測中電泳條件、凝膠性質對結果的影響。自1961年Hall等對核酸雜交技術的開創至今，雜交技術在實驗室和臨床的研究應用愈加廣泛。Bai等[10]通過PCR結合反向雜交技術，用兩種特異性探針對504例臨床分離株進行了檢測鑒定，成功區分出M.avium和M.intracellulare，準確率達100%。Wang等[11]應用反向線點雜交技術快速鑒定了36例鐮刀菌的標準株及臨床分離株的種群分類。此外，de Koning等和Mckechnie等[12-13]對雜交技術檢測病毒及生殖器感染菌種也進行了相關研究，證實了其高效準確的鑒定結果。本次研究中對10種皮膚感染性肉芽腫常見病原菌新設計探針進行驗證，在此基礎上以選定的探針及實驗確定的臨界值，用10種標準株的菌懸液對“擬芯片”法的敏感性、特異性進行檢測。結果顯示，其敏感性為1×10～1×102個菌細胞/ml，特異性高(100%)，各病原菌間無交叉。其中，真菌組中裴氏著色真菌和F.Monophora因共用同一探針，且因后者毒力更強易致系統感染而更具危害性，故在本方法檢測陽性時需進一步測序明確菌種。今后，需進一步研究該方法用于直接檢測感染組織中病原菌的可行性。

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2014-01-06)

(本文編輯:吳曉初)

Development of a microplate-reverse hybridization method for the detection and identification of common pathogens in lesions of cutaneous infectious granuloma

Yan Zhenzhen，Jiang Haiqin，Sun Jianfang，Shen Yongnian，Cui Pangen，Liu Weijun，Wang Hongsheng，Liu Weida.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s：Wang Hongsheng，Email：whs33@vip.sina.com；Liu Weida，Email：liumyco@hotmail.com

ObjectiveTo develop a microplate-reverse hybridization method combined with PCR-enzymelinked immunosorbent assay(quot;simulant chipquot;)for the detection and identification of common species of mycobacteria and fungi in lesions of cutaneous infectious granuloma.MethodsTwo universal primers for mycobacteria and fungi，as well as specific probes for 10 common pathogens of cutaneous infectious granuloma(includingMycobacterium tuberculosis，Mycobacterium leprae，Mycobacterium marinum，Mycobacterium abscessus，Mycobacterium fortuitum，Sporotrichum schencki，Cladosporium carrionii，Fonseceea pedrosoi，Fonseceea monophoraandCandida albicans)，were designed.To test the performance of the universe primers，PCR was performed with them to amplify corresponding fragments from the standard strains of the 10 pathogens followed by sequencing.Aquot;simulant chipquot;method was developed with the specific probes，and used to detect 10 standard and 19 clinical strains of these pathogens in simulated tissue specimens.The sensitivity and specificity of this method were determined.ResultsThe corresponding fragments were amplified from all the standard strains by PCR with the two pairs of universal primers，and these PCR products were confirmed to match with the expected genes.As thequot;simulant chipquot;method showed，the absorbance value was 0.041 ± 0.02 for negative specimens，and the cut-off point was determined as 0.101 for this method.At this cut-off point，the detection limit of thequot;simulant chipquot;method was 1×101to 1×102cells/ml for these pathogens.No cross reaction was observed for these specific probes between these 10 pathogens.The genotyping results for these clinical isolates were consistent between thequot;simulant chipquot;method and DNA sequencing.ConclusionThe establishedquot;simulant chipquot;method is a rapid method for the detection and identification of common pathogens from cutaneous infectious granuloma.

Granuloma；Mycobacteriuminfections；Fungal infections；Oligonucleotide reverse hybridization techniques

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.007

衛生部部屬(管)醫院臨床學科重點項目(2010-2012-125)

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所

王洪生，Email:whs33@vip.sina.com；劉維達，Email:liumyco@hotmail.com