Th17和Treg細胞與蕈樣肉芽腫相關性研究

黎釗 王平 侯秀麗 劉東銀 王媚 鄭俊惠

Th17和Treg細胞與蕈樣肉芽腫相關性研究

黎釗 王平 侯秀麗 劉東銀 王媚 鄭俊惠

目的探討調節性T(Treg)細胞和Th17細胞在蕈樣肉芽腫不同分期中的變化。方法流式細胞儀檢測28例蕈樣肉芽腫、13例大斑塊型副銀屑病、17例扁平苔蘚患者及10例健康對照外周血Treg細胞和Th17細胞百分率，同時應用免疫組化法檢測40例蕈樣肉芽腫、13例副銀屑病、17例扁平苔蘚及10例健康對照蠟塊組織中叉頭狀轉錄因子P3(FOXP3)和白細胞介素17(IL-17)的表達。結果蕈樣肉芽腫、副銀屑病、扁平苔蘚患者外周血Treg細胞百分率分別為(8.09±1.68)%，(6.53±1.67)%，(2.84±1.16)%較健康對照[(1.01±0.35)%]升高，差異均有統計學意義。蕈樣肉芽腫、副銀屑病患者外周血Treg細胞百分率亦高于扁平苔蘚(均P＜0.05)；蕈樣肉芽腫與副銀屑病患者差異無統計學意義(P＞0.05)。外周血Th17細胞百分率在蕈樣肉芽腫較副銀屑病、扁平苔蘚患者比健康人升高[(3.22±0.82)%比(2.46±0.79)%，(1.38±0.47)%和(0.59±0.30)%，均P＜0.05]。FOXP3陽性率在蕈樣肉芽腫、副銀屑病及扁平苔蘚均高于正常皮膚組織[(14.94±4.46)%，(11.95±4.72)%，(6.32±2.81)%比(3.43±1.79)%，均P＜0.05]，蕈樣肉芽腫及副銀屑病比扁平苔蘚高(均P＜0.05)，蕈樣肉芽腫比副銀屑病差異無統計學意義(P＞0.05)。IL-17陽性率在蕈樣肉芽腫、副銀屑病、扁平苔蘚和正常組織中分別為(15.89±4.27)%，(12.02±3.34)%，(4.84±1.93)%和(2.62±0.89)%，其中，蕈樣肉芽腫均高于副銀屑病、扁平苔蘚組織及正常組織(均P＜0.05)。蕈樣肉芽腫、副銀屑病外周血Th17/Treg細胞比率比扁平苔蘚、健康對照低(0.41±0.11，0.39±0.12比0.50±0.06，0.57±0.19(均P＜0.05)。早期蕈樣肉芽腫Th17細胞與Treg細胞呈正相關(r=0.423，P＜0.05)，腫瘤期蕈樣肉芽腫Th17細胞有所下降，而Treg細胞繼續升高，但蕈樣肉芽腫各期差異無統計學意義，且二者在腫瘤期無相關性。結論Treg和Th17細胞失衡可能參與了蕈樣肉芽腫的發生與發展。

蕈樣肉芽腫；T淋巴細胞，調節性；Th17細胞

蕈樣肉芽腫(MF)是原發于皮膚的、具有相對惰性病程的皮膚T細胞淋巴瘤[1]。與某些皮膚T細胞異常增生性疾病存在關聯，如大斑塊型副銀屑病、扁平苔蘚等[2]。其主要特征是CD4+異形T細胞的克隆性增生，來源于皮膚特有的“皮膚T細胞”，通過表面分子如人皮膚淋巴細胞相關抗原、CCR4、CXCR3、整合素αEβ7、淋巴細胞功能相關分子等與皮膚的內皮細胞、角質形成細胞、朗格漢斯細胞的相應配體結合，向表皮呈特征性的移入與聚集[3]。MF的這種生物學行為不僅由發生基因突變的腫瘤細胞相關因子決定，同時也與其相互作用的非腫瘤細胞和基質等有關[4]。目前，研究發現Treg細胞和Th17細胞在感染性疾病[5-6]、自身免疫性疾病[7-8]、MF等腫瘤性疾病[9-10]的發生、發展及治療后的評估方面發揮重要作用。我們認為，MF病期與Treg及Th17細胞的失衡可能密切相關，并對MF中Treg細胞、Th17細胞的實驗室指標作出相關性分析，以期為揭示MF的發病機制提供一種思路。

資料與方法

1.標本:收集我院皮膚科2008—2013年經臨床及組織病理學檢查證實的40例MF、13例副銀屑病、17例扁平苔蘚及10例健康對照組織石蠟存檔標本。40例 MF均經免疫組化(CD3、CD4和CD45RO陽性等)和(或)基因重排證實診斷，每例均進行 TNMB(tumor，node，metastasis，and blood)分級，具有完整臨床及組織病理學資料。40例MF中，女13例，男 27例；發病年齡(47.1±20.0)歲；按1975年美國MF研究協作小組的 T細胞淋巴瘤TNM分期法:斑片期17例，斑塊期20例，腫瘤期3例。并對以上相關患者進行隨訪，血液標本來源于28例MF患者、13例副銀屑病患者、17例扁平苔蘚患者及10例健康對照。28例MF中，女10例，男18例；發病年齡(32.4±16.0)歲；斑片期12例，斑塊期15例，腫瘤期1例。本研究獲得杭州市第三人民醫院倫理委員會批準，入選病例均簽署知情同意書。未滿18歲患兒征得其監護人同意，并簽署知情同意書。

2.試劑:人類Treg/Th17試劑盒以及同型對照抗體均產自美國BD公司；佛波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)混合液產自杭州聯科公司；兔抗人叉頭狀轉錄因子P3(FOXP3)、白細胞介素(IL)17單克隆抗體(236A/E7)產自英國Abcam公司，即用型ChemMateEnVision兔/鼠通用型免疫組化試劑盒均產自丹麥Dako公司；淋巴細胞分離液產自美國Sigma公司；RPMI1640培養液產自美國Gibco公司；胎牛血清產自杭州四季青公司。

3.流式細胞儀檢測Treg、Th17細胞的百分率:采集患者肘靜脈血5 ml，肝素抗凝，2 045×g離心15 min分離血漿，貯存于-80℃冰箱中備用。將下層血細胞與磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶1混合，并緩慢加入4 ml淋巴細胞分離液中獲得外周血單一核細胞(PBMC)。在含有10%胎牛血清的RPMI1640 8 ml培養液中重懸PBMC，加入4 μl PMA/離子霉素混合物(PMA 12.5 mg/L，離子霉素 0.25 g/L)和 4 μl的BD GolgiStopTM蛋白轉運抑制劑(包含莫能霉素)，在37℃，5%CO2的培養箱中培養5 h。離心，應用染色緩沖液(FBS)洗滌1遍，調整細胞濃度為2×106/ml，按照Th17/TregPhenotyPing試劑盒進行操作，上流式細胞儀進行檢測。

4.免疫組化EnVision法檢測FOXP3、IL-17的表達:將標本切片(3 μm厚度)，裱于防脫載物片，常規脫蠟、水化后，置pH9.0乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液中水浴熱修復95～98℃30 min；每張切片加1滴3%過氧化氫溶液室溫下孵育10 min；PBS沖洗，加入FOXP3、IL-17單抗37℃孵育 1 h；PBS再次沖洗滴加二抗37℃孵育30 min；增敏二氨基聯苯胺(DAB)顯色2 min；蘇木素復染，脫水、透明、封片。扁桃體組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，HE染色作組織學對照。鏡下以胞核和(或)胞質見棕黃色或棕褐色反應物為陽性，每張切片隨機選10個高倍(×400)視野，計算陽性細胞及淋巴細胞總數。觀察指標:陽性標記指數(labeling index，LI)即陽性率 =(陽性表達細胞總數/該區域內淋巴細胞總數)×100%。

5.統計分析方法:采用SPSS17.0統計軟件進行實驗數據分析。以±s表示，各組Th17細胞、Treg細胞比較采用單因素方差分析。應用Pearson相關分析法確定Th17細胞與Treg細胞的相關性。

結 果

1.外周血中Treg和Th17細胞的百分率:見表1。MF、副銀屑病、扁平苔蘚患者外周血Treg細胞較健康對照升高(均P＜0.05)，MF、副銀屑病患者亦高于扁平苔蘚患者(均P＜0.05)，MF患者與副銀屑病相比差異無統計學意義(P＞0.05)。MF患者外周血Th17細胞較副銀屑病、扁平苔蘚患者、健康對照升高(均P＜0.05)；副銀屑病患者Th17細胞較扁平苔蘚患者、健康對照均升高(均P＜0.05)；扁平苔蘚患者Th17細胞較健康對照升高(P＜0.05)。MF、副銀屑病患者外周血Th17/Treg細胞比率較扁平苔蘚患者、健康對照低(均P＜0.05)；MF患者與副銀屑病患者差異無統計學意義(P＞0.05)，扁平苔蘚患者與健康對照比較差異亦無統計學意義(P＞0.05)。斑片期、斑塊期及腫瘤期MF患者Th17細胞比例分別為(2.48±0.75)%、(2.67±0.88)%、3.76%，Treg細胞比例分別為(7.60±1.68)%、(8.16±1.45)%、9.63%，三期之間 Th17細胞(F=3.211，P＞ 0.05)、Treg細胞(F=1.983，P＞0.05)比較差異均無統計學意義。

2.組織中FOXP3和IL-17的表達:見圖1，2，表 2，3。MF、副銀屑病及扁平苔蘚組織FOXP3均明顯高于健康對照皮膚組織，差異均有統計學意義(均P＜0.05)；MF及副銀屑病組織FOXP3較扁平苔蘚組織高(均P＜0.05)；MF組織FOXP3表達較副銀屑病差異無統計學意義(P＞0.05)。MF組織IL-17表達較副銀屑病、扁平苔蘚、健康對照組織升高(均P＜0.05)；副銀屑病IL-17表達較扁平苔蘚、健康對照組織升高(均P＜0.05)；扁平苔蘚IL-17表達較健康對照組織升高(P＜0.05)。另外，對于MF不同分期的研究發現，雖然各期差異無統計學意義，但是隨著MF病情的進展，FOXP3的表達逐漸升高，IL-17的表達在紅斑、斑塊期逐漸升高，至腫瘤期則有所下降。

表1 各組患者和健康對照外周血Th17和Treg細胞百分率比較(±s)

表1 各組患者和健康對照外周血Th17和Treg細胞百分率比較(±s)

注:a:與健康對照組比較，P ＜0.05；b:與扁平苔蘚患者比較，P ＜0.05；c:與副銀屑病患者比較，P ＜0.05

組別 例 Treg細胞(%) Th17細胞(%) Th17/Treg蕈樣肉芽腫 28 8.09±1.68ab 3.22±0.82abc 0.41±0.11ab副銀屑病 13 6.53±1.67ab 2.46±0.79ab 0.39±0.12ab扁平苔蘚 17 2.84±1.16a 1.38±0.47a 0.50±0.06健康對照 10 1.01±0.35 0.59±0.30 0.57±0.19 F值 33.24 29.97 12.03 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 免疫組化檢測皮膚組織中FOXP3的表達(×200) FOXP3分別在斑片期(1a)、斑塊期(1b)、腫瘤期(1c)蕈樣肉芽腫胞核中呈棕褐色強陽性表達；1d:FOXP3在大斑塊副銀屑病胞核中呈中等陽性表達；1e:FOXP3在扁平苔蘚胞核中呈弱陽性表達；1f:FOXP3在健康對照中呈陰性表達

3.外周血中Treg與Th17細胞相關性在健康對照(r=0.801，P＜ 0.05)、扁平苔蘚(r=0.969，P＜0.05)及副銀屑病(r=0.746，P＜ 0.05)中，患者外周血Treg細胞與Th17細胞的百分率呈正相關；在早期MF(斑片期/斑塊期)患者外周血中Treg細胞與Th17細胞的數量亦呈正相關，r=0.423，P＜0.05，但在腫瘤期則無相關性。

表2 各組皮膚組織中FOXP3、白細胞介素17陽性表達率比較(±s)

表2 各組皮膚組織中FOXP3、白細胞介素17陽性表達率比較(±s)

注:a:與健康對照比較，P＜0.05；b:與扁平苔蘚患者比較，P＜0.05；c:與副銀屑病患者比較，P＜0.05

組別 例 FOXP3(%) 白細胞介素17(%)蕈樣肉芽腫 40 14.94±4.46ab 15.89±4.27abc副銀屑病 13 11.95±4.72ab 12.02±3.34ab扁平苔蘚 17 6.32±2.81a 4.84±1.93a健康對照 10 3.43±1.79 2.62±0.89 F值 28.42 31.95 P值 ＜0.01 ＜0.01

表3 蕈樣肉芽腫各期FOXP3、白細胞介素17在組織中陽性表達率比較(±s)

表3 蕈樣肉芽腫各期FOXP3、白細胞介素17在組織中陽性表達率比較(±s)

組別 例 FOXP3(%) 白細胞介素17(%)斑片期 17 13.70±6.23 14.85±6.30斑塊期 20 15.53±5.26 16.34±5.35腫瘤期 3 17.57±1.32 15.58±0.96 F值 0.431 0.56 P值 ＞0.05 ＞0.05

討 論

Treg和Th17細胞在不同的細胞因子環境下分化而成，具有不同的生物學功能。研究發現Treg細胞和Th17細胞均參與了自身免疫性疾病、感染、腫瘤和移植排斥等疾病的發生和發展，決定了疾病的預后和轉歸，成為近來免疫學研究中的一個熱點。人們在充分探討Treg細胞及Th17細胞各自的分化、調節機制的同時，也在尋找兩種細胞之間的相互作用在相關疾病發生發展中的變化[11]。在MF中也曾有兩種T細胞亞群的報道[12-13]，但對于Treg細胞及Th17細胞在MF各期的變化及之間相互作用尚未有研究。

我們研究發現，MF患者外周血中Treg、皮損中FOXP3的表達均高于副銀屑病、扁平苔蘚患者及健康對照，但MF患者與副銀屑病差異無統計學意義。關于副銀屑病和MF之間的確切關系目前還沒有一致的觀點。有研究發現，約61%的副銀屑病可發展為MF[11]。Burg等[12]研究結果亦顯示副銀屑病是MF的早期表現。我們發現FOXP3+Treg在MF和副銀屑病中的表達差異無統計學意義。在對不同分期MF研究中發現，隨著疾病進展，FOXP3陽性表達率逐漸升高，這種增多可能為腫瘤細胞的免疫逃逸提供條件，進而促進腫瘤的發生、發展。

圖2 免疫組化檢測皮膚組織中IL-17的表達(×200) IL-17分別在斑片期(2a)、斑塊期(2b)、腫瘤期(2c)蕈樣肉芽腫胞質中呈棕褐色強陽性表達；2d:IL-17在大斑塊副銀屑病胞質中呈中等陽性表達；2e:IL-17在扁平苔蘚胞質中呈弱陽性表達；2f:IL-17在健康對照中呈陰性表達

本研究結果顯示，外周血中Th17細胞、皮損中IL-17的表達在炎癥性皮膚病、有腫瘤發展傾向的炎癥性皮膚病及MF早期中的表達有逐步增高的趨勢，這與Cirée等[13]的研究結果相似，但是，在對僅有的3例MF腫瘤期患者的研究中發現，IL-17、Th17細胞表達相比早期有所減少，表明其參與MF的發生、發展過程。IL-17、Th17細胞在MF進展中到底發揮促腫瘤作用還是抗腫瘤作用，仍需要深入的研究。我們研究亦發現，Th17細胞和Treg細胞在健康對照、扁平苔蘚及副銀屑病患者中呈正相關，而對MF不同分期的研究發現:Th17細胞與Treg細胞在早期MF進展中呈正比，表明二者存在相互作用；腫瘤期MF因為樣本量小，暫無相關性表現。

因此，MF患者存在Th17/Treg細胞失衡現象，表明其參與了MF的發生、發展過程。這對揭示MF的發病機制提供了一種新的思路。由于本研究所包含的腫瘤期MF病例較少，Th17細胞和Treg細胞在腫瘤期MF發病過程中的相互作用有待于擴大樣本量進一步研究。

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2013-09-04)

(本文編輯:尚淑賢)

Association analysis between T helper type 17 cells，regulatory T cells and mycosis fungoides

Li Zhao*，Wang Ping，Hou Xiuli，Liu Dongyin，Wang Mei，Zheng Junhui.*Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Wang Ping，Email：dermwang@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the changes of T helper type 17(Thl7)cells and regulatory T(Treg)cells in different stages of mycosis fungoides.MethodsFlow cytometry was performed to determine the percentage of Treg and Th17 cells in peripheral blood from 28 patients with mycosis fungoides(MF)，13 patients with large plaque parapsoriasis(PP)，17 patients with lichen planus(LP)and 10 healthy human controls，and immunohistochemistry to detect the expressions of forkhead box protein 3(FOXP3)and interleukin(IL)-17 in tissue specimens from 40 patients with MF，13 with PP，17 with LP and 10 healthy human controls.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance and Pearson correlation analysis.ResultsAs far as the percentage of Treg cells in peripheral blood was concerned，MF，PP and LP patients were significantly higher than the healthy controls(8.09% ±1.68%，6.53% ±1.67%and 2.84% ±1.16%vs.1.01% ±0.35，allP＜0.05)，PP patients were higher than LP patients and healthy controls(bothP＜ 0.05)，and LP patients were higher than healthy controls(P＜0.05).The percentage of Th17 cells in peripheral blood was significantly increased in MF patients compared with PP patients，LP patients and healthy controls(3.22% ±0.82%vs.2.46% ±0.79%，1.38% ±0.47%and 0.59% ± 0.30%，allP＜ 0.05).Elevated expression rate of FOXP3 was observed in MF，PP and LP lesions as compared with normal skin(14.94% ±4.46%，11.95% ±4.72%，6.32% ±2.81%vs.3.43% ±1.79%，allP＜ 0.05)，and in MF and PP lesions compared with LP lesions(bothP＜ 0.05)，but no significant difference was observed between MF and PP lesions(P＞0.05).There was a significant increase in the expression rate of IL-17 in MF lesions compared with PP lesions，LP lesions and normal skin(15.89% ±4.27%vs.12.02% ±3.34%，4.84% ±1.93%and 2.62% ±0.89%，allP＜0.05).The Th17/Treg ratio in peripheral blood was significantly lower in MF and PP patients than in LP patients and healthy controls(0.41±0.11 and 0.39±0.12 vs.0.50±0.06 and 0.57±0.19，allP＜ 0.05).A positive correlation was observed between the proportion of Thl7 cells and Treg cells(r=0.423，P＜ 0.05)in patients with early-stage MF，but not in those with tumor-stage MF.The proportion of Th17 cells decreased，but that of Treg cells continuously increased in patients with tumor-stage MF.However，no significant difference was noted in the proportion of Thl7 cells or Treg cells among patients with different stages of MF.ConclusionThe imbalance between Treg and Th17 cells may be involved in the occurrence and development of MF.

Mycosis fungoides；T lymphocytes，regulatory；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.008

浙江省醫藥衛生科技計劃項目(2014KYB200)；杭州市醫學重點專科專病項目(20100733Q08)

310009杭州市第三人民醫院皮膚科(黎釗、王平、劉東銀、王媚、鄭俊惠)；安徽醫科大學附屬杭州臨床學院(侯秀麗)

王平，Email:dermwang@aliyun.com