卡介菌多糖核酸對(duì)尖銳濕疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

王振華 楊芳紅 孫怡 王輝 薛峰

卡介菌多糖核酸對(duì)尖銳濕疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

王振華 楊芳紅 孫怡 王輝 薛峰

目的探討卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)對(duì)尖銳濕疣(CA)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的影響。方法42例首次發(fā)病的CA患者分成聯(lián)合治療組(26例)和電灼組(16例)，聯(lián)合治療組給予電灼后肌內(nèi)注射BCG-PSN 0.35 mg隔日1次連續(xù)3個(gè)月，電灼組只進(jìn)行電灼治療，在初診時(shí)和3個(gè)月后分別進(jìn)行Treg細(xì)胞的檢測(cè)，觀察療效及Treg細(xì)胞水平的變化。另有健康體檢者30例作為健康對(duì)照組。結(jié)果CA患者外周血Treg細(xì)胞水平明顯高于健康對(duì)照組(8.31%±1.24%比5.15%±0.72%，P＜0.01)，其中復(fù)發(fā)組較未復(fù)發(fā)組高(9.34%±0.72%比7.45%±0.85%，P＜0.01)；聯(lián)合治療組復(fù)發(fā)率明顯低于電灼組(30.77%比68.75%，P＜0.05)，3個(gè)月后Treg細(xì)胞水平下降，明顯低于電灼組(5.87%±1.05%比6.60%±0.75%，P＜0.05)。結(jié)論Treg細(xì)胞比值的高低與CA患者疾病的轉(zhuǎn)歸有密切的關(guān)系，比值越高越容易復(fù)發(fā)。BCG-PSN可通過(guò)降低Treg細(xì)胞的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)CA患者的抗病毒免疫應(yīng)答，改善其預(yù)后。

尖銳濕疣；卡介菌多糖核酸；CD4-陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞；FoxP3

尖銳濕疣(condyloma acuminata，CA)是人乳頭瘤病毒(HPV)感染導(dǎo)致的復(fù)發(fā)率較高的性傳播性疾病，其發(fā)病、復(fù)發(fā)與機(jī)體的免疫功能有密切關(guān)系。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是受關(guān)注的免疫細(xì)胞，有研究證實(shí)，Treg細(xì)胞與CA的發(fā)病有密切相關(guān)性[1-2]。卡介菌多糖核酸(BCGPSN)是從卡介菌中提取的一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)，在CA的治療中發(fā)揮著一定的作用。為進(jìn)一步探討Treg細(xì)胞與CA的關(guān)系以及BCG-PSN對(duì)CA患者外周血Treg細(xì)胞的影響，我們應(yīng)用BCG-PSN聯(lián)合電灼治療CA并觀察了治療前后Treg細(xì)胞水平的變化，報(bào)告如下。

一、對(duì)象和方法

(一)對(duì)象:2012年10月至2013年9月來(lái)我科門診就診的首次發(fā)病CA患者42例，其中男30例，女12例；年齡19～52歲，平均(31.02±8.37)歲；病程(21.71± 9.69)d，皮損0.3～3 cm，數(shù)目4～35個(gè)，平均(15.83±7.41)個(gè)。 所有入選病例均具有典型的臨床表現(xiàn)，皮疹醋酸白試驗(yàn)陽(yáng)性，有非婚性接觸史。排除標(biāo)準(zhǔn):有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、合并其他性病或者感染性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、妊娠、近半年內(nèi)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑或者免疫調(diào)節(jié)劑者。另外選取我院體檢中心健康體檢者30例作為健康對(duì)照組。兩組的年齡、性別經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P＞0.05)。

(二)方法:

1.試劑與儀器:熒光標(biāo)記單克隆抗體CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE 及同型對(duì)照小鼠 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、熒光標(biāo)準(zhǔn)微球及破膜固定液均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所。流式細(xì)胞儀FACSCalibur為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

2.實(shí)驗(yàn)方法:抽取靜脈血4 ml，肝素抗凝。Ficoll密度梯度離心法用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離單一核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為10×106/ml，取兩支試管，分別加入100 μl細(xì)胞懸液(1×106)，分為同型對(duì)照管和檢測(cè)管。同型對(duì)照管加小鼠IgG1-FITC及 IgG1-APC 10 μl， 檢測(cè)管加 CD4-FITC及CD25-APC 10 μl熒光標(biāo)記單抗，室溫避光孵育30 min；PBS洗滌后，固定破膜，然后同型對(duì)照管加IgG1-PE、檢測(cè)管加Foxp3-PE抗體各10 μl，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后，重懸細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定。Treg細(xì)胞以CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞比值表示。

3.治療方法:將CA患者分為兩組，完成隨訪者42例，其中聯(lián)合治療組26例，電灼組16例。聯(lián)合治療組在常規(guī)消毒后局部浸潤(rùn)麻醉，外涂5%醋酸以顯示亞臨床病灶，之后應(yīng)用GX-Ⅲ型多功能電離子治療機(jī)(廣西科學(xué)院應(yīng)用物理研究所)對(duì)皮損進(jìn)行電灼祛除，之后應(yīng)用BCG-PSN(商品名迪蘇，浙江萬(wàn)馬藥業(yè)有限公司)肌內(nèi)注射，隔日0.35 mg，連續(xù)3個(gè)月，電灼組只進(jìn)行電灼祛除皮損。兩組患者隨訪時(shí)若發(fā)現(xiàn)CA復(fù)發(fā)則繼續(xù)給予電灼治療。為保證可比性，所有電灼治療操作由同一組醫(yī)護(hù)人員完成。

所有CA患者初次就診時(shí)詳細(xì)記錄其皮損的部位、數(shù)量、病程并檢測(cè)Treg細(xì)胞比值，以后每半個(gè)月隨訪1次，連續(xù)3個(gè)月，觀察療效及不良反應(yīng)。隨訪結(jié)束再檢測(cè)1次Treg細(xì)胞比值。祛除皮損后連續(xù)3個(gè)月不復(fù)發(fā)判為痊愈，3個(gè)月隨訪期間皮損又出現(xiàn)則判為復(fù)發(fā)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.CA患者Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比較健康對(duì)照組者顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。聯(lián)合治療組26例CA患者在隨訪期間復(fù)發(fā)8例，復(fù)發(fā)率30.77%，而電灼組16例中復(fù)發(fā)11例，復(fù)發(fā)率68.75%，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=5.77，P＜ 0.05。 見(jiàn)表1。

2.聯(lián)合治療組和電灼組在初次就診時(shí)Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3個(gè)月隨訪結(jié)束該數(shù)值在兩組中都較初次就診時(shí)下降(均P＜0.01)，但是聯(lián)合治療組下降更為明顯，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

3.不良反應(yīng):聯(lián)合治療組和電灼組均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

三、討論

Treg細(xì)胞能夠通過(guò)抑制抑制CD4+和CD8+細(xì)胞的IL-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來(lái)抑制T細(xì)胞的活化和增殖，并能控制由樹(shù)突細(xì)胞誘導(dǎo)的Th1和Th2的分化，從反向調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱程度，影響細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)作用，并形成持續(xù)感染[1，3]。我們研究發(fā)現(xiàn)，CA患者外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比較健康對(duì)照組者顯著升高，其中復(fù)發(fā)組又較未復(fù)發(fā)組高，這與以往的研究結(jié)果一致[1，4]，提示CA患者體內(nèi)存在明顯的免疫抑制狀態(tài)，而Treg細(xì)胞比值的高低與CA患者疾病的轉(zhuǎn)歸又有密切的關(guān)系，比值越高越容易復(fù)發(fā)。

表1 尖銳濕疣患者和健康對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比值(±s)

表1 尖銳濕疣患者和健康對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比值(±s)

注:a:與健康對(duì)照組比較，P＜0.01；b:與未復(fù)發(fā)組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) Treg細(xì)胞比值(%)尖銳濕疣組 42 8.31±1.24a復(fù)發(fā)組 19 9.34±0.72b未復(fù)發(fā)組 23 7.45±0.85健康對(duì)照組 30 5.15±0.72

表2 聯(lián)合治療組和電灼組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞治療前后的比值(%，±s)

表2 聯(lián)合治療組和電灼組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞治療前后的比值(%，±s)

注:a:治療前后比較，均P＜0.01

組別 例數(shù) 初診時(shí)Treg細(xì)胞比值隨訪結(jié)束時(shí)Treg細(xì)胞比值(%)聯(lián)合治療組 26 8.03±1.19 5.87±1.05a電灼組 16 8.76±1.21 6.60±0.75a t值 1.916 2.390 P值 ＞0.05 ＜0.05

有學(xué)者觀察到，BCG-PSN能使CA患者外周血CD4+/CD8+比值和IL-2水平升高，使CD8+百分率和可溶性白細(xì)胞介素2受體(sIL-2R)水平降低，提示BCG-PSN對(duì)CA患者的免疫功能有良好的調(diào)節(jié)作用[5]。我們研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組CA患者應(yīng)用BCG-PSN3個(gè)月后，其復(fù)發(fā)率明顯低于電灼組，而且其外周血Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率明顯下降，低于原本差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的電灼組CA患者的相關(guān)數(shù)值，提示BCG-PSN能逆轉(zhuǎn)CA患者的免疫抑制，能通過(guò)降低Treg細(xì)胞的數(shù)量來(lái)正向調(diào)節(jié)CA患者的抗病毒免疫應(yīng)答，改善CA疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。至于具體機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

[1]錢起豐，盧創(chuàng)林，張明霞.CA患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)[J].中華皮膚科雜志，2008，41(5)：311-313.

[2]劉慧賢，王振華.CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞與HPV感染的相關(guān)性[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2013，29(5)：328-330.

[3]Sakaguchi S，Yamaguchi T，Nomura T，et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell，2008，133(5)：775-787.

[4]Cao Y，Zhao J，Lei Z，et al.Local accumulation of FOXP3+regulatory T cells：evidence for an immune evasion mechanism in patients with large condylomata acuminata[J].J Immunol，2008，180(11)：7681-7686.

[5]肖嶸，李干群，張桂英，等.卡介菌多糖核酸對(duì)尖銳濕疣患者的免疫調(diào)節(jié)作用及臨床療效[J].中華皮膚科雜志，2001，34(3)：214.

2014-02-26)

(本文編輯:吳曉初)

Effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin on CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in peripheral blood of patients with condyloma acuminatum

Wang Zhenhua，Yang Fanghong，Sun Yi，Wang Hui，Xue Feng.Department of Dermatology，Weifang People's Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Wang Zhenhua，Email：wfzcwzh@126.com

ObjectiveTo evaluate the effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin(BCG-PSN)on peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+regulatory T(Treg)cells in patients with condyloma acuminatum(CA).MethodsForty-two patients with first onset of CA were randomly assigned to receive either injection of BCG-PSN(0.35 mg every other day for 3 months)after fulguration(combination group，26 patients)，or fulguration only(fulguration group，16 patients).Venous blood samples were obtained from all the patients at the initial visit and three months after the beginning of treatment，as well as from 30 healthy checkup examinees.The percentage of peripheral Treg cells in CD4+T lymphocytes was determined by flow cytometry.The recurrence of CA was evaluated during the three months after the beginning of treatment.ResultsThe percentage of peripheral Treg cells in CD4+T lymphocytes was significantly higher in patients with CA than in the controls(8.31%±1.24%vs.5.15% ±0.72%，P＜0.01)，and in patients with clinical recurrence of CA than in those without(9.34% ±0.72%vs.7.45% ±0.85%，P＜0.01).The recurrence rate was significantly lower in the combination group than in the fulguration group(30.77%vs.68.75%，P＜ 0.05).After three months of treatment，the combination group showed lower percentage of Treg cells in CD4+T cells compared with the fulguration group(5.87%±1.05%vs.6.60%±0.75%，P＜0.05).Conclusions The percentage of Treg cells has a close relationship with the progression of CA，i.e.，the higher the percentage，the more frequent the relapse.BCG-PSN may enhance the antiviral immune response in patients with CA and improve their prognosis by reducing the number of Treg cells.

Condylomata acuminata；BCG-PSN；CD4-positive T-lymphocytes；FoxP3

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.018

261041山東，濰坊市人民醫(yī)院皮膚科

王振華，Email:wfzcwzh@126.com