MEF2A基因多態性位點及其冠心病相關性

黃新次

武漢市普愛醫院檢驗科，湖北武漢 430033

據不完全統計在2013年全球共有超過1500 萬人死于冠狀動脈粥樣硬化心臟病[1]。既往研究發現冠心病的危險因素眾多包括血脂代謝、高血壓、高血糖、肥胖、吸煙、高尿酸血癥等等[2]。近幾年來隨著分子遺傳學的高速發展,學者們發現基因多態性與冠心病有密切的聯系[3]。因此筆者擬收集該院心血管內科100 例診斷為冠狀動脈粥樣硬化心臟病的病人作為研究組，同期100 例來該院進行健康體檢未患冠狀動脈粥樣硬化心臟病的正常人作為對照組，收集時間為2011年4月—2014年4月，目的為調查冠狀動脈粥樣硬化心臟病的病人與健康人群中9、11 號外顯子多態性位點（891C/T 中TT、CT；1294～1296CCG 中DD、DW；1305G/A中AA、GA）中的突變頻率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集該院心血管內科100 例診斷為冠狀動脈粥樣硬化心臟病的病人作為研究組，同期100 例來該院進行健康體檢未患冠狀動脈粥樣硬化心臟病的正常人作為對照組。研究組，平均年齡（45.2±6.9）歲，其中男性55 人，女性45 人；對照組，年齡（47.1±5.5）歲，其中男性60 人，女性40 人。2 組人員性別，年齡差異無統計學意義。所有研究對象均簽定知情同意書。

1.2 入選標準

入選標準：①就診時臨床資料、治療經過完整。②冠狀動脈粥樣硬化心臟病的診斷符合中華醫學會心內科學分會關于冠狀動脈粥樣硬化心臟病的診斷與鑒別診斷[4]。③每個研究對象能自愿參與該次研究。

1.3 排除指標

①入院時生命體征不平穩的患者。②有各種急性、慢性感染,嚴重肝、腎功能不全,惡性腫瘤,自身免疫性疾病者，藥物有過敏、惡性心律失常者。③對照組中患有冠心病、或有冠狀動脈粥樣硬化心臟病家族史。

1.4 研究方法

1.4.1 主要試劑 TaqDNA 聚合酶；EZNA 膠回收試劑；DTCS StartDNA 試劑盒。

1.4.2 儀器與材料 PCR 儀器、垂直電泳槽及電泳儀(上海精密儀器有限公司)、凝膠成像儀、TICK400-測序儀、日本島津UV265 紫外分光儀。

1.4.3 引物和探針 引物由日本TEIL 杭州生物公司合成,引物序列參考Lusis AJ 等[7]的研究,其余引物用FACE-maker 軟件自行設計。

1.4.4 DNA 提取 用EDTA 抗凝收集研究對象外周血5 mL，采用鹽析法提取基因組DNA。

1.4.5 PCR 擴增 使用40 μl 反應體系,PCR 緩沖液,NaCl 為2.0 mmol/L,1 μmol/L 上下游引物,0.2 mmol/LdNTP,Taq DNA 聚合酶0.8 U。循環參數如下:5 min 94 ℃預變性,退火20 s,72 ℃延伸20 s,循環40 次。從基因組DNA 中擴增MEF2A 基因的外顯子。

1.4.6 SSCP 分析 8 μlPCR 擴增產物和2 μl 緩沖液混合,先96 ℃加熱10 min 后立即冰浴,上樣于聚丙烯酰胺凝膠,240 V 電泳3 h,銀染。

1.4.7 DNA 測序 PCR 產物全部上樣瓊脂糖凝膠，用E·EZNA 膠回收試劑純化產物。PCR 正向、反向引物擴增,進行核苷酸序列測定,最終數據用DNA 分析軟件比對,并用Chromas 軟件測定序列變異。

1.5 統計方法

將資料錄入SPSS18.0 軟件。計數資料采頻數描述，用χ2檢驗法。

2 結果

2.1 兩組人群9、11 號外顯子多態性位點的檢測

研究組和對照組MEF2A 基因的9 號外顯子多態性位點有891C/T 變異，11 號外顯子多態性位點有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T，見圖1、圖2。

圖1 9 號外顯子多態性位點

圖2 11 號外顯子多態性位點

2.2 研究組和對照組9、11 號外顯子多態性位點突變頻率的比較

研究組與對照組891C/T 中TT、CT 點位突變頻率分別為（56%、43%；4%、8%）,差異有統計學意義（P<0.05）;研究組與對照組1294～1296CCG 中DD、DW 點位突變頻率分別為（46%、47%；9%、11%）,差異有統計學意義（P<0.05）;研究組與對照組1305G/A中AA、GA 突變頻率分別為（51%、37%；6%、7%）,差異有統計學意義（P<0.05）;研究組與對照組1353G/T 中GT、GG 點位突變頻率分別為（76%、54%；13%、12%）,差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 研究組和對照組9、11 號外顯子多態性位點突變頻率的比較

3 討論

MEF2A 基因廣泛在血管平滑肌和內皮細胞中有表達，對冠狀動脈的發育起重要作用[5]。有國外學者發現白兔的MEF2A 存在多態性，因此采取基因酶切除法將白兔MEF2A 多態性點位切除，結果顯示10 d 后白兔血管異常,肌纖維破裂[6]。因此該研究認為MEF2A 基因結構位點多態性與冠心病可能密切相關。

該研究發現研究組和對照組中MEF2A 基因的9、11 號外顯子均存在多態性位點。9 號外顯子表明有891C/T 變異，11 號外顯子有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 變異。但是該研究進一步比較發現：研究組與對照組891C/T 中TT、CT 點位突變頻率分別為（56%、43%；4%、8%）,差異有統計學意義（P<0.05）;研究組與對照組1294～1296CCG 中DD、DW 點位突變頻率分別為（46%、47%；9%、11%）,差異有統計學意義（P<0.05）;研究組與對照組1305G/A 中AA、GA 突變頻率分別為（51%、37%；6%、7%）,差異有統計學意義（P<0.05）;研究組與對照組1353G/T 中GT、GG點位突變頻率分別為（76%、54%；13%、12%）,差異有統計學意義（P<0.05）說明891C/T，1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 點位的變異與冠心病的發病有關。國外同樣有報道，9 號外顯子表明有891C/T 變異，11 號外顯子有1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T變異，與該次研究一致[8]。該研究發現11 號外顯子的3 個多態性點位離國際公認的冠心病11 號外顯子21 bp 缺失點位非常接近，我們認為可能的原因是MEF2A 基因第11 號外顯子中CAG重復序列（重復片段在5～20 個不等）使DNA 聚合酶的在復制階段產生錯誤識別,DNA 復制錯誤,這些錯誤的片段沒有被酶切后，固定在DNA 長鏈上后，導致第11 號外顯子顯示多個多態性位點[7]。研究發現MEF2A 基因11 號外顯子CAG 下游有脯氨酸重復序列，與冠心病密切相關，而這些重復的脯氨酸重復序列可以導致1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 點位的變異，與該次研究一致[9]。

綜上所述，MEF2A 作為肌細胞增強因子家族的一員，編碼轉錄因子,調節心肌和骨骼肌細胞的增殖、分化和凋亡[10]。筆者認為冠狀動脈粥樣硬化心臟病的病人MEF2A 基因結構位點891C/T、1294～1296CCG、1305G/A、1353G/T 點位突變頻率明顯高于正常人，MEF2A 基因多態性與冠心病明顯相關。

[1]Dodou E,Sparrow DB,Mohun T,et al.MEF2 proteins,including MEF2A,are expressed in bothmuscle and non2muscle cells[J].Nucleic AcidsRes,2014,23(4).

[2]YusufS,Reddy S,Tnpuu S,et al.Globalburden ofcardiovascular diseases part I:general considerations,the epidemiologic transition,risk factors,and impact of urbanization[J].Circulation,2011,104(23).

[3]LusisAJ.Atherosclerosis[J].Nature,2012,407(11).

[4]Nora JJ,LortscherRH,SpanglerRD,et al.Genetic2epidemiologic study of early2onset ischemic heart disease[J].Circulation,2013,61(16).

[5]Schildkraut JM,Myers RH,Cupples LA,et al.Coronary risk associated with age and sex of parental heart disease in the Framingham Study[J].Am JCardio,2014,64(9).

[6]Olson EN.Coronary artery disease and the MEF2A transcription factor[J].SciAgingKnowlEnviron,2013,48(2).

[7]Lusis AJ,Fogelman AM,Fonarow GC.Genetic basis of atherosclerosis:part I,new genes and pathways[J]Circulation,2014,110(6).

[8]Lusis AJ,Fogelman AM,Fonarow GC.Genetic basis of atherosclerosis:partⅡ,clinical implications[J].Circulation,2014,110(34).

[9]McKinseyTA,Zhang CL,Olson EN.MEF2:a calcium dependeregulator of cell division,differentiation and death[J].Trends Biochem Sc,i 2002,27(8).

[10]Edmondson DG,LyonsGE,Martin JF,et a.l Mef gene expression marks the cardiac and skeletal muscle lineages during mouse embryogenesis[J].Development,2014,120(3).

[11]Black BL,Olson EN.Transcriptional control ofmuscle development bymyocyte enhancer factor22(MEF2)proteins[J].Annu RevCellDev Bio,2013,14(55).

[12]Wang LJ,Fan C,Topol SE,et al.Mutation of MEF2A in an inherited disorderwith features of coronary artery disease[J].Science,2014,302(5).