全淋巴區(qū)電子線照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠療效觀察與機(jī)制探討

丁文 于湛 宋智琦

全淋巴區(qū)電子線照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠療效觀察與機(jī)制探討

丁文 于湛 宋智琦

目的觀察全淋巴區(qū)電子線照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠的療效，并探討其與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系。方法將18只4月齡的MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、放射治療組、地塞米松治療組，每組6只，雌雄各半，陰性對(duì)照組予生理氯化鈉溶液0.5 ml腹腔注射每日1次，連續(xù)2周；放射治療組全身淋巴結(jié)予電子線照射，2 Gy/d，每周5次，連續(xù)2周；地塞米松治療組予地塞米松1 mg/kg腹腔注射每日1次，連續(xù)2周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2周測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)24 h尿蛋白，ELISA法檢測(cè)各組小鼠ANA及抗dsDNA抗體水平，直接免疫熒光法觀察各組小鼠IgG抗體在腎臟的沉積情況，PAS染色法觀察各組小鼠的腎臟情況，流式細(xì)胞儀測(cè)定各組小鼠脾臟細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例。用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多樣本組間單因素方差。結(jié)果放射治療組小鼠24 h尿蛋白含量為(3.33±0.17)mg，陰性對(duì)照組為(3.97±0.33)mg，兩組比較，P＜0.05。放射治療組小鼠血清抗核抗體ANA水平為(275.12±30.18)U/ml，抗小鼠dsDNA抗體為(455.74±43.38)IU/ml；陰性對(duì)照組小鼠分別為(434.82±36.63)U/ml和(956.78±37.69)IU/ml，兩組比較，均為P＜0.05。放射治療組與地塞米松治療組小鼠腎小球內(nèi)IgG沉積較陰性對(duì)照組減少，強(qiáng)度較弱，放射治療組、地塞米松治療組兩組無明顯差異。PAS染色可見放射治療組與地塞米松治療組腎臟病變較陰性對(duì)照組減輕，放射治療組、地塞米松治療組兩組無明顯差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，放射治療組小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例為(1.08±0.52)%，地塞米松治療組為(1.18±0.60)%，陰性對(duì)照組為(0.38±0.14)%，放射治療組、地塞米松治療組兩組的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例較陰性對(duì)照組升高(P＜0.05)。結(jié)論全淋巴區(qū)電子線照射能降低MRL/lpr狼瘡小鼠尿蛋白、血清抗核抗體、雙鏈DNA抗體水平，對(duì)腎臟病理改變亦有恢復(fù)作用，其機(jī)制可能與提高體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例有關(guān)。

小鼠，近交MRL lpr；紅斑狼瘡，系統(tǒng)性；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；淋巴照射

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一類以多種自身抗體產(chǎn)生及繼發(fā)免疫復(fù)合物沉著為特點(diǎn)的自身免疫性疾病。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑是目前主要的治療藥物，但長時(shí)間應(yīng)用可出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[1]。斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心應(yīng)用千伏X線全淋巴區(qū)照射技術(shù)(total lymphoid irradiation，TLI)治療難治性狼瘡患者，取得了較好的臨床療效[2]。但千伏X線照射皮膚劑量高，劑量跌落慢，照射靶目標(biāo)后方的正常組織受照劑量高[3]。MRL/lpr小鼠為SLE模型小鼠，可出現(xiàn)抗dsDNA抗體、高滴度的ANA抗體、輕中度的蛋白尿，腎臟可出現(xiàn)免疫復(fù)合物腎小球腎炎[4]等。SLE的發(fā)病與T淋巴細(xì)胞過度活化及功能異常導(dǎo)致多克隆B細(xì)胞活化密切相關(guān)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞。CD4+CD25+Treg即目前主要的Treg細(xì)胞群[5]。目前認(rèn)為，F(xiàn)oxp3可作為Treg細(xì)胞群的特異性標(biāo)記物[6]。近年有報(bào)道[5]，Treg細(xì)胞群對(duì)放射線具有較好的耐受性。本研究采用電子線施全淋巴區(qū)照射技術(shù)治療MRL/lpr狼瘡小鼠，探討全淋巴區(qū)照射治療SLE的作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、動(dòng)物與材料

1.MRL/lpr小鼠：體重(32±2.5)g，16周齡，雌雄各9只，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；SPF級(jí)，合格證編號(hào)：SCXK(蘇)2010-0001。動(dòng)物在25～27℃、45%～50%濕度的半屏障系統(tǒng)環(huán)境下飼養(yǎng)。所有小鼠均自由攝食攝水，普通飼料飼養(yǎng)。

2.主要試劑與設(shè)備：異硫氰熒光素(FITC)抗小鼠 CD4、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(PerCP)抗小鼠 CD25、PE抗小鼠 Foxp3(美國Biolegend公司)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(美國Southern Biotech公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀集團(tuán)有限公司)；小鼠紅細(xì)胞裂解液(美國BD公司)；生理氯化鈉溶液(青島華仁藥業(yè)股份有限公司)；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)；小鼠抗核抗體(ANA)試劑盒及抗小鼠dsDNA抗體試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；Varian Clinac 23EX醫(yī)用直線加速器(美國Varian公司)；FACS Vantage流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

二、動(dòng)物分組與處理

將18只MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，3雄3雌。陰性對(duì)照組：予生理氯化鈉溶液腹腔注射，每日1次，每次0.5 ml，連續(xù)2周；放射治療組：將大部分顱骨、肋骨、肺、后足及尾部用鉛板遮蓋起來后，露出全身主要淋巴組織，予VARIAN CLINAC 23EX醫(yī)用直線加速器用6 MeV電子線照射下頜骨、頸部、腋窩、腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)區(qū)以及胸腺、脾臟，每次2 Gy，每周5次，連續(xù)2周(圖1)；地塞米松治療組，予地塞米松1 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)2周；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2周檢測(cè)3組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)。

三、小鼠24 h尿蛋白檢測(cè)

代謝籠法收集各組小鼠24 h尿液后，按照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書檢測(cè)24 h尿蛋白含量。

四、小鼠血清ANA及抗dsDNA水平檢測(cè)

摘取眼球法取小鼠外周血，300×g離心10 min，收集上層血清檢測(cè)。按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定小鼠血清ANA及抗小鼠dsDNA抗體的含量。

五、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3)在CD4+細(xì)胞群中所占比例檢測(cè)

斷頸處死小鼠，取脾臟組織制備脾細(xì)胞懸液后，加入紅細(xì)胞裂解液，計(jì)數(shù)重懸，使100 μl懸液中含106個(gè)細(xì)胞。加入FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體2 μl，PerCP標(biāo)記的抗鼠CD25抗體2 μl。4℃避光20 min后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入新鮮配制的破膜液1 ml，4℃保存。4 h后用破膜緩沖液洗滌后，加入高親和力抗鼠CD16/32封閉Fc段15 min。加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的Foxp3單克隆抗體 2 μl，4℃避光30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠的CD4+CD25+Foxp3占CD4+細(xì)胞群的百分比。

六、小鼠腎臟腎小球IgG免疫復(fù)合物沉積檢測(cè)

小鼠斷頸處死后，取一側(cè)腎臟組織制作成冰凍切片。直接免疫熒光法觀察小鼠腎臟腎小球IgG免疫復(fù)合物的沉積情況：滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，將切片置于濕盒內(nèi)，37℃孵育45 min，室溫2 h。用pH 7.4的0.01 mol/L PBS洗片3次，每次3 min(置搖床)。于4℃冰箱避光放置。熒光顯微鏡下觀察腎小球IgG免疫復(fù)合物的沉積情況。

七、小鼠腎臟病理變化檢測(cè)

取另一側(cè)小鼠腎臟組織進(jìn)行高碘酸雪夫染色(PAS)，觀察各組小鼠腎臟病理變化情況。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、全淋巴區(qū)電子線照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠后各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果

照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)變化見表1。可見電子線放射治療能降低MRL/lpr狼瘡小鼠尿蛋白含量，減少小鼠血清中ANA及抗dsDNA抗體水平，提高小鼠脾臟Treg占CD4+細(xì)胞群的比例。以上各指標(biāo)經(jīng)方差分析，3個(gè)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、小鼠腎臟腎小球IgG免疫復(fù)合物沉積結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察，放射組與地塞米松組較陰性對(duì)照組小鼠腎小球內(nèi)IgG免疫復(fù)合物沉積減少，強(qiáng)度減弱(圖2)。

三、小鼠腎臟病理變化

PAS染色觀察各組小鼠腎臟情況示(圖3)，陰性對(duì)照組小鼠腎臟系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)彌漫性重度增生，并可見小新月體形成，腎小球內(nèi)皮下和上皮下可見大量嗜伊紅物質(zhì)沉積。放射組及地塞米松組小鼠腎臟病變程度較陰性對(duì)照組減輕，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)輕中度增生，未見新月體，腎小球內(nèi)皮下和上皮下嗜伊紅物質(zhì)沉積減少。

表1 全淋巴區(qū)電子線照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)變化(±s)

表1 全淋巴區(qū)電子線照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)變化(±s)

注：a：小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3)在CD4+細(xì)胞群中所占比例

組別 只數(shù) 24 h尿蛋白(mg)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞a(%)陰性對(duì)照組 6 3.97±0.33 434.82±36.63 956.78±37.69 0.38±0.14放射治療組 6 3.33±0.17 275.12±30.18 455.74±43.38 1.08±0.52地塞米松治療組 6 3.32±0.23 284.79±18.20 475.40±34.86 1.18±0.60 F值 13.41 55.86 320.82 5.26 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05血清ANA含量(U/ml)血清dsDNA抗體含量(IU/ml)

圖1 醫(yī)用直線加速器電子線照射MRL/lpr小鼠全身淋巴結(jié) 1a：遮蓋小鼠的鉛板，遮蓋大部分顱骨、肋骨、肺臟、后足及尾部，中間鏤空處露出全身主要淋巴組織；1b：予6 MeV電子線照射全身主要淋巴結(jié)下頜骨、頸部、腋窩、腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)及胸腺、脾臟

圖2 直接免疫熒光法觀察各組MRL/lpr小鼠腎小球IgG免疫復(fù)合物沉積情況(×100) 2a：陰性對(duì)照組；2b：放射組；2c：陽性對(duì)照組。放射組與陽性對(duì)照組較陰性對(duì)照組小鼠腎小球內(nèi)毛細(xì)血管襻的熒光強(qiáng)度減弱，IgG免疫復(fù)合物沉積減少

討 論

Treg是一種功能成熟的T細(xì)胞亞群，具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特點(diǎn)。Treg在T細(xì)胞群中對(duì)放射又具有較高的耐受性[5]，故放射治療后Treg所占的比例升高。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的增高，可以使機(jī)體在放射治療后的免疫功能重建中，對(duì)自身抗原重新產(chǎn)生耐受，異常的免疫反應(yīng)減弱，自身抗體減少，從而達(dá)到新的免疫平衡，最終達(dá)到治療疾病的目的。在本研究中，放射治療后狼瘡小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，且Treg所占比例升高，因此，我們認(rèn)為該治療作用的機(jī)制可能為通過電子線全淋巴區(qū)照射，使大部分免疫細(xì)胞群發(fā)生凋亡，而Treg對(duì)放射線不敏感，數(shù)量下降不明顯，因此數(shù)量相對(duì)增高。Treg的相對(duì)數(shù)量增加，可使機(jī)體在放射治療后的免疫功能重建中，對(duì)自身抗原重新產(chǎn)生耐受，異常的免疫反應(yīng)減弱，從而達(dá)到了新的免疫平衡。本研究中，地塞米松組的Treg比例亦增高。驗(yàn)證了糖皮質(zhì)激素類藥物可調(diào)節(jié)Treg的比例治療紅斑狼瘡。

圖3 各組MRL/lpr小鼠腎臟PAS染色(×400) 3a：陰性對(duì)照組；可見系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞明顯增殖，基底膜明顯增厚；3b：放射組；基底膜增厚較陰性對(duì)照組略為減輕；3c：陽性對(duì)照組；細(xì)胞增殖及基底膜增厚較陰性對(duì)照組明顯減輕

Matsumoto等[7]發(fā)現(xiàn)，攜帶lpr基因的小鼠里Fas基因抗原基因和胸腺內(nèi)自身反應(yīng)性T細(xì)胞負(fù)選擇存在著缺陷，因?yàn)镸RL/lpr小鼠體內(nèi)lpr基因的突變，不能產(chǎn)生功能性Fas抗原，從而使自身反應(yīng)性T細(xì)胞逃避胸腺負(fù)選擇而大量釋放進(jìn)入外周器官，造成自身免疫疾病的發(fā)生[8]。MRL/lpr小鼠的壽命多為5～7個(gè)月，死因通常為免疫性腎小球腎炎[9]。可有腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜增生，偶可有新月體生成，間質(zhì)內(nèi)可有明顯的單核細(xì)胞浸潤[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，放射組治療后，小鼠腎臟病變程度較陰性對(duì)照組減輕，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生減輕。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，放射組與陰性對(duì)照組比較，尿蛋白含量明顯下降，因此，全淋巴區(qū)電子線照射治療對(duì)于小鼠腎臟病理改變的恢復(fù)具有較好的療效。

全淋巴區(qū)照射技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是精確度較高，擺位簡單，計(jì)量均勻，可以保護(hù)正常組織特別是肺臟免受照射，從而避免間質(zhì)性肺炎的發(fā)生，減輕全身不良反應(yīng)。以往利用的是千伏X線全淋巴區(qū)照射，千伏X線的皮膚劑量高，劑量跌落慢，照射靶目標(biāo)后方的正常組織受照射劑量高。而本研究采用電子線，可以更好地保護(hù)正常組織[3]，彌補(bǔ)了以往千伏X線的不足。目前，全淋巴區(qū)電子線照射治療的長期預(yù)后仍不確定，主要擔(dān)心其會(huì)增加罹患各種腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。Samuel等[12]對(duì)接受全淋巴區(qū)電子線放射治療的SLE患者進(jìn)行了長達(dá)12～79個(gè)月的隨訪，觀察發(fā)現(xiàn)，治療3個(gè)月后，患者的血清學(xué)指標(biāo)及腎臟病變指標(biāo)均有顯著改善，并且效果可持續(xù)3年之久。雖治療后患者的T輔助淋巴細(xì)胞有明顯下降，但隨后可恢復(fù)，且不孕不育、感染及惡性血液腫瘤風(fēng)險(xiǎn)均比接受烷化劑藥物治療者低。

本研究的小鼠照射野[13]主要為下頜骨淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、胸腺和脾臟這些全身主要淋巴結(jié)，而將小鼠的大部分顱骨、肋骨、肺臟、后足及尾部用鉛板遮蓋，減少了全身不良反應(yīng)。但本實(shí)驗(yàn)只研究了14 d內(nèi)全淋巴區(qū)照射治療MRL/lpr狼瘡小鼠的療效，未發(fā)現(xiàn)全淋巴區(qū)照射治療的不良反應(yīng)，今后有必要進(jìn)行長期治療的療效及其不良反應(yīng)觀察。

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2013-04-01)

(本文編輯：顏艷)

Therapeutic efficacy and mechanism of total lymphoid irradiation with electron beam in MRL/lpr mouse model of lupus

Ding Wen，Yu Zhan，Song Zhiqi.First Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116011，China

s:Song Zhiqi，Email:szqdalian@yahoo.com；Yu Zhan，Email:yuzhan@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic efficacy of total lymphoid irradiation with electronic beam in MRL/lpr mouse model of lupus，and to assess the relationship between total lymphoid irradiation and regulatory T(Treg)cells.MethodsEighteen four-month-old MRL/lpr lupus mice were randomly divided into three groups with three female mice and three male mice in each group:negative control group treated with intraperitoneal sodium chloride physiological solution 0.5 ml once daily，radiotherapy group receiving total lymphoid irradiation with the electronic beam(2 Gy per day)five times a week，and dexamethasone group treated with intraperitoneal dexamethasone 1 mg/kg once daily for two consecutive weeks.Then，Coomassie brilliant blue method was used to quantify the 24-hour urinary protein，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the serum levels of antinuclear antibody(ANA)and anti-dsDNA antibody.All the mice were sacrificed，renal tissue was obtained and subjected to direct immunofluorescence assay for the observation of IgG deposits as well as periodic acid-Schiff staining for the evaluation of renal injury，and spleen tissue was isolated and subjected to flow cytometry for the determination of proportion of Treg cells in spleen cells.Data were processed using the SPSS 11.5 software.Statistical analysis was done with one-way analysis of variance.ResultsSignificant differences were observed between the radiotherapy group and negative control group in 24-hour urinary protein level((3.33±0.17)vs.(3.97±0.33)mg，P＜0.05)，serum ANA antibody level((275.12±30.18)vs.(434.82±36.63)U/ml，P＜0.05)and anti-dsDNA antibody level((455.74±43.38)vs.(956.78±37.69)IU/ml，P＜0.05).The glomerular deposition of IgG antibody was obviously decreased with attenuated renal injury in the radiotherapy group and dexamethasone group compared with the negative control group，but no significant difference was noted between the radiotherapy group and dexamethasone group.The proportion of Treg cells in the radiotherapy group and dexamethasone group was significantly higher than that in the negative control group((1.08±0.52)%and(1.18±0.60)%vs.(0.38±0.14)%，bothP＜0.05).ConclusionsTotal lymphoid irradiation with electronic beam can effectively reduce urine protein level，serum ANA and anti-dsDNA antibody level in MRL/lpr lupus mice，alleviate renal injury，likely by up-regulating the proportion of Treg cellsin vivo.

Mice，inbred MRL lpr；Lupus erythematosus，systemic；T-lymphocytes，regulatory；Lymphatic irradiation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.005

116011大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

宋智琦，Email：szqdalian@yahoo.com；于湛，Email：yuzhan@yahoo.com