他克莫司及金黃色葡萄球菌腸毒素B對(duì)特應(yīng)性皮炎外周血Th17細(xì)胞的影響

喻瀘 王華 羅曉燕

他克莫司及金黃色葡萄球菌腸毒素B對(duì)特應(yīng)性皮炎外周血Th17細(xì)胞的影響

喻瀘 王華 羅曉燕

目的探討Th17細(xì)胞在急性期特應(yīng)性皮炎(AD)患兒外周血單一核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)，他克莫司和金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)對(duì)AD患兒外周血Th17細(xì)胞的影響。方法分離急性期中、重度AD患兒及健康對(duì)照兒童PBMC，分別加入佛波酯和離子霉素、他克莫司、金黃色葡萄球菌腸毒素B培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Th1、Th2細(xì)胞比例，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17、IFN-γ、IL-4表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)Th17特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)。結(jié)果佛波酯和離子霉素處理后，AD患兒外周血Th17、Th2細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-4水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。Th1細(xì)胞比例及IFN-γ水平低于健康對(duì)照組(P＜0.01)，ROR γt mRNA高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。 他克莫司處理后，AD組和對(duì)照組IL-17、IFN-γ、IL-4及ROR γt mRNA水平均顯著降低(P＜0.01)。SEB處理后，AD組Th17細(xì)胞比例，IL-17和RORγt mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，Th1細(xì)胞比例及IFN-γ水平低于對(duì)照組(P＜0.01)，Th2細(xì)胞比例及IL-4水平高于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論他克莫司對(duì)AD患兒和健康對(duì)照PBMC分泌IL-17、IFN-γ、IL-4均有明顯的抑制作用。SEB增強(qiáng)AD患兒外周血Th17細(xì)胞表達(dá)。

皮炎，特應(yīng)性；他克莫司；葡萄球菌，金黃色；腸毒素類(lèi)；Th17細(xì)胞

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種與遺傳有關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，主要見(jiàn)于兒童和青少年，目前該病在發(fā)達(dá)國(guó)家患病率已接近20%[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞參與慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等發(fā)病。AD患者存在皮膚屏障功能缺陷，伴有金黃色葡萄球菌(金葡菌)定植增加，金葡菌腸毒素B(SEB)作為超抗原能加重AD炎癥，而Th17細(xì)胞在此過(guò)程中是否發(fā)揮免疫防御機(jī)制值得探討。他克莫司作為一種免疫抑制劑，能緩解AD急性期炎癥，是否通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分化途徑實(shí)現(xiàn)治療目的尚不清楚。本研究旨在探討Th17細(xì)胞在AD患兒外周血中的表達(dá)，他克莫司、SEB對(duì)外周血Th17細(xì)胞的影響。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2011年11月至2012年11月于我院皮膚科門(mén)診就診的急性期AD患兒86例，其中男50例，女36例，年齡(0.25～14.75)歲，平均(5.39±4.04)歲，所有AD患兒均符合Hanifin-Rajka標(biāo)準(zhǔn)[2]，用歐洲特應(yīng)性皮炎SCORAD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)疾病嚴(yán)重度指數(shù)進(jìn)行評(píng)估(總分103)，評(píng)分33～80，平均56.12±11.85。且在2周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物以及口服抗組胺藥物，4周內(nèi)未接受系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。對(duì)照組81例均為本院體檢的健康兒童，其中男48例，女 33例，年齡(2.92～14.08)歲，平均(5.65±2.02)歲，無(wú)特應(yīng)性疾病史。本研究通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)。

二、試劑與儀器

1.主要試劑：佛波酯和離子霉素(ionomycin)購(gòu)于美國(guó)Alexis公司，他克莫司、SEB購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津TBD公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibeco公司，異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CD8單抗、藻紅蛋白-吲哚菁(PE-Cy5)標(biāo)記的抗人CD3單抗 、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的同型對(duì)照IgG1單抗購(gòu)于北京四正柏公司，藻紅蛋白標(biāo)記的抗人腫瘤壞死因子 γ(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)，白介素 17(IL-17)單抗購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司，細(xì)胞固定/破膜劑(Cytofix/Cytoperm)、細(xì)胞洗劑(Perm/Wash)、高爾基體阻斷劑莫能霉素(Gal-stop monensin)購(gòu)于美國(guó)BD公司。Trizol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，RORγt mRNA引物購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，PCR熒光染料(SsoFast EvaGreen Supermix)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，抗人 IFN-γ、IL-4、IL-17 ELISA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)CBS公司。

2.主要儀器：FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，ELISA檢測(cè)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司。

三、方法

1.標(biāo)本與細(xì)胞分離：急性期中、重度AD患兒及健康對(duì)照兒童外周血5 ml，肝素或EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單一核淋巴細(xì)胞(PBMC)，重懸于含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109/L，培養(yǎng)于24孔板。

2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th細(xì)胞亞群：取上述細(xì)胞懸液(2×109/L)1 ml置于24孔板，分別加入佛波酯(50 μg/L)+離子霉素(1 mg/L)、金葡菌腸毒素B(20 mg/L)及莫能霉素(1 μmol/L)終濃度，37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(佛波酯+離子霉素組4 h、金葡菌腸毒素B組24 h)，移細(xì)胞懸液至1.5 ml微量離心管，1500 ×g，離心 5 min，棄上清，PBS洗2次后行流式細(xì)胞儀分析。Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)。

3.ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子：分別加入佛波酯(50 μg/L)、離子霉素(1 mg/L)終濃度、他克莫司(1 μg/L)終濃度，金葡菌腸毒素B(1 mg/L)終濃度，37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，1500 ×g，離心5 min，收集上清，-80℃保存。同時(shí)收集細(xì)胞沉淀至1.5 ml去酶微量離心管中。

4.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)RORγt mRNA：于上述細(xì)胞沉淀中加入Trizol裂解液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，染料法(EvaGreen)進(jìn)行相對(duì)熒光定量。RORγt引物設(shè)計(jì)為F：5'-GTGCTGGTTAGGATGTGCCG-3'，R：5'-GTGG GAGAAGTCAAAGATGGA-3'，135 bp。 內(nèi)參 GAPDH引物設(shè)計(jì)為F：5'-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG C-3'，R：5'-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGTGTC-3'，116 bp。通過(guò)建立RORγt mRNA和GAPDH mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算獲得各樣本CT值(Y軸)與起始相對(duì)拷貝數(shù)的log值(X軸)曲線(xiàn)斜率slope和相關(guān)系數(shù)R2。擴(kuò)增效率E=[10-1/slope-1]×100%。用美國(guó)Bio-Rad公司Gene Expression Analysis for iCycle iQ?實(shí)時(shí)PCR Detection System軟件，計(jì)算各樣本目的基因相對(duì)表達(dá)量。

5.統(tǒng)計(jì)分析：用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均使用±s表示，組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組年齡比較用方差分析，性別比較用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血Th17/Th1/Th2細(xì)胞比例

佛波酯+離子霉素刺激培養(yǎng)PBMC 4 h，細(xì)胞膜表面標(biāo)記和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示，AD患兒組(n=86)CD3+CD8-IL-17+(Th17)細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組(n=81，P＜0.01)；CD3+CD8-IFN-γ+(Th1) 細(xì)胞比例低于健康對(duì)照組(P＜0.01)；CD3+CD8-IL-4+(Th2)細(xì)胞高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。金葡菌腸毒素B(20 mg/L)刺激培養(yǎng)PBMC 24 h，流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示，AD患兒組Th17細(xì)胞比例高于健康對(duì)照組(P＜0.05)；Th1細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P＜0.01)；Th2細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

二、金葡菌腸毒素B對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17/IFN-γ/IL-4的影響

金葡菌腸毒素B(1 mg/L)刺激PBMC 24 h，ELISA檢測(cè)IL-17/IFN-γ/IL-4結(jié)果顯示，AD組IL-17、IL-4水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)，IFN-γ水平明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

三、金葡菌腸毒素B對(duì)RORγt mRNA表達(dá)的影響

金葡菌腸毒素B(1 mg/L)刺激PBMC 24 h，RTPCR法檢測(cè)RORγt mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，金葡菌腸毒素B處理后AD組(22例)明顯高于健康對(duì)照組(18例)(1.51±1.05比0.39±0.28，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、他克莫司對(duì)培養(yǎng)上清細(xì)胞IL-17/IFN-γ/IL-4的影響

佛波酯 +離子霉素加或不加他克莫司(1 μg/L)刺激培養(yǎng) PBMC 24 h，ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，佛波酯+離子霉素處理后AD組IL-17和IL-4水平明顯高于健康對(duì)照組，IFN-γ水平低于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；佛波酯 +離子霉素+他克莫司處理后AD組和健康對(duì)照組IL-17、IFN-γ、IL-4水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

五、他克莫司對(duì)RORγt mRNA表達(dá)的影響

佛波酯+離子霉素加或不加他克莫司(1 μg/L)處理PBMC 24 h，RT-PCR法檢測(cè)RORγt mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，佛波酯 +離子霉素處理后AD組RORγt mRNA表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)；佛波酯+離子霉素+他克莫司處理后AD組和健康對(duì)照組RORγt mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

討 論

Th17細(xì)胞的主要特點(diǎn)是產(chǎn)生IL-17A(IL-17)、IL-17F、IL-22和IL-6等炎性細(xì)胞因子，其中以IL-17A為主。另外，Th17細(xì)胞的分化不依賴(lài)于Th1、Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3，孤核受體(Orphan nuclear receptor，RORγt)是調(diào)控其分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[3]。IL-17是Th17細(xì)胞參與AD的主要效應(yīng)細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞可能通過(guò)增強(qiáng)Th2細(xì)胞功能、促進(jìn)多種炎癥因子分泌、增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞免疫活性等途徑參與AD病理生理過(guò)程。

表1 金葡菌腸毒素B處理后白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

注：a：與健康對(duì)照組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) 白介素17 腫瘤壞死因子γ 白介素4健康對(duì)照組 24 284.23±84.69 943.98±254.07 274.51±48.67特應(yīng)性皮炎組 24 593.50±119.16a548.46±99.70a462.71±109.63a

圖1 表達(dá)白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4的T細(xì)胞分析 1a：同型對(duì)照IgG設(shè)門(mén)；1b：表達(dá)白介素17；1c：表達(dá)腫瘤壞死因子γ；1d：表達(dá)白介素4

表2 他克莫司處理前后白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

表2 他克莫司處理前后白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

注：a：與健康對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與佛波酯+離子霉素組比較，P＜0.01

組別 例數(shù)佛波酯+離子霉素+他克莫司健康對(duì)照組 22 369.57±107.22 147.66±67.69b 1123.66±218.36 380.67±128.54b 294.30±59.01 134.12±34.71b特應(yīng)性皮炎組 22 638.01±152.85a 160.87±65.63b 653.53±133.80a 305.87±86.16b 537.15±160.73a 161.36±33.48b白介素17 腫瘤壞死因子γ 白介素4佛波酯+離子霉素佛波酯+離子霉素+他克莫司佛波酯+離子霉素佛波酯+離子霉素+他克莫司佛波酯+離子霉素

表3 他克莫司處理前后ROR γt mRNA表達(dá)(±s)

表3 他克莫司處理前后ROR γt mRNA表達(dá)(±s)

注：a：與健康對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與佛波酯 +離子霉素組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) 佛波酯+離子霉素佛波酯+離子霉素+他克莫司健康對(duì)照組 22 0.83±0.44 0.20±0.18b特應(yīng)性皮炎組 24 2.64±2.31a 0.26±0.23b

本研究結(jié)果顯示，AD患兒外周血Th2細(xì)胞和IL-4水平明顯高于健康對(duì)照組，Th1細(xì)胞及IFN-γ水平低于對(duì)照組，提示急性期AD患兒外周血存在Th2細(xì)胞高表達(dá)。AD患者存在Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-4表達(dá)增加，Th1細(xì)胞及IFN-γ水平相對(duì)降低[4-5]，我們發(fā)現(xiàn)，急性期AD患兒外周血Th17細(xì)胞和IL-17表達(dá)也顯著高于對(duì)照組，與Koga等[6]報(bào)道結(jié)果相同。另外，我們還發(fā)現(xiàn)AD患兒外周血Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA水平顯著高于健康對(duì)照兒童。

研究報(bào)道，他克莫司能顯著抑制正常人PBMC產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和 TNF-α，在自身免疫性疾病的研究中，人們也發(fā)現(xiàn)他克莫司具有抑制初始T細(xì)胞向Th1、Th2、Th17細(xì)胞分化，減少其相關(guān)細(xì)胞因子合成的作用[7-8]。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)他克莫司在早期移植物排斥反應(yīng)中對(duì)Th1、Th2、Th17細(xì)胞并無(wú)明顯抑制作用。Chung等[10]則發(fā)現(xiàn)他克莫司可抑制Th1和Th2細(xì)胞反應(yīng)，并呈劑量依賴(lài)性，而對(duì)Th17細(xì)胞無(wú)論濃度多大均無(wú)抑制作用。因此，他克莫司對(duì)Th17細(xì)胞有無(wú)抑制作用尚存爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司明顯降低AD患兒和健康對(duì)照兒童外周血Th1、Th2細(xì)胞表達(dá)，減少I(mǎi)FN-γ和IL-4生成，同時(shí)對(duì)AD患兒及健康對(duì)照兒童Th17細(xì)胞均有明顯抑制作用，減少I(mǎi)L-17合成，同時(shí)對(duì)Th17細(xì)胞關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)也有顯著抑制作用，提示他克莫司通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分化可能是實(shí)現(xiàn)緩解AD急性炎癥的途徑之一。

已知AD患者皮膚表面有大量金葡菌定植，金葡菌超抗原金葡菌腸毒素B能使初始CD4+T細(xì)胞前體向Th2細(xì)胞分化，產(chǎn)生B細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使大量IgE產(chǎn)生，遷移至皮膚，Th2細(xì)胞釋放的IL-4、IL-5趨化嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥部位皮膚聚集，繼而產(chǎn)生IL-1，IL-6和IL-17，后者可正反饋加強(qiáng)Th2細(xì)胞數(shù)量及分化規(guī)模，從而參與AD急性炎癥進(jìn)程[11]。本研究結(jié)果顯示，金葡菌腸毒素B體外刺激PBMC后，與健康對(duì)照相比，AD患兒組Th2細(xì)胞亞群及其相關(guān)因子IL-4表達(dá)升高。Ma等[12]發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞缺陷的個(gè)體更易受金葡菌感染，AD患者皮膚斑貼試驗(yàn)處分離出來(lái)的浸潤(rùn)性T細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，金葡菌腸毒素B對(duì)IL-17產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，提示Th17細(xì)胞可能對(duì)抗金葡菌感染有一定的防御作用。我們發(fā)現(xiàn)，金葡菌腸毒素B處理后AD組患兒Th17細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA和IL-17水平均顯著高于對(duì)照組，提示Th17/IL-17可能是金葡菌腸毒素B加重AD炎癥的途徑之一，為此我們下一步擬對(duì)IL-17受體進(jìn)行阻斷后證實(shí)。

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2013-08-20)

(本文編輯:吳曉初)

Effect of tacrolimus andStaphylococcus aureusenterotoxin B on T helper 17 cells in peripheral blood from patients with atopic dermatitis

Yu Lu，Wang Hua，Luo Xiaoyan.Department of Dermatology，Children's Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Luo Xiaoyan，Email:luoxycq@hotmail.com

ObjectiveTo determine the proportion of T helper 17(Th17)cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)from children with acute atopic dermatitis(AD)，and to evaluate the effect of tacrolimus andStaphylococcus aureusenterotoxin B(SEB)on the proportion.MethodsPBMCs were separated from 86 children with moderate to severe acute AD and 81 healthy children，and cultured in the presence of phorbol ester(PMA)and ionomycin with or without tacrolimus or SEB for different durations.Then，flow cytometry was performed to determine the proportions of Th17，Th1 and Th2 cells，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the levels of interleukin(IL)-17，interferon(IFN)-γ and IL-4 in the culture supernatant of these cells，and real-time fluorescence-based quantitative PCR(RT-PCR)to detect the expression level of RORγt mRNA.Statistical analysis was done by using two independent samplest-test，chi-square test and analysis of variance.ResultsAfter stimulation with PMA and ionomycin，there was a significant increase in the proportions of Th2 and Th17 cells in，supernatant levels of IL-17 and IL-4 and mRNA expression level of RORγt of，but a significant decrease in Th1 cell percentage in and IFN-γ supernatant level of，PBMCs from patients with AD compared with PBMCs from the healthy controls(allP＜0.01).The combination treatment with tacrolimus significantly reduced the supernatant levels of IL-17，IFN-γ，IL-4 and RORγt mRNA expression level of PBMCs from both the patients and healthy controls compared with those treated with PMA and ionomycin only(allP＜0.01).In comparison with the healthy controls，the patients with AD showed significantly higher proportions of Th17 and Th2 cells in，supernatant levels of IL-17 and IL-4 of，and expression level of RORγt mRNA of，but significantly lower proportion of Th1 cells in and IFN-γ supernatant level of，PBMCs after SEB treatment(allP＜0.01).ConclusionsTacrolimus evidently inhibits the secretion of IL-17，IFN-γ and IL-4 by PBMCs from both children with AD and healthy children，while SEB can up-regulate the proportion of peripheral blood Th17 cells in children with AD.

Dermatitis，atopic；Tacrolimus；Staphylococcus aureus；Enterotoxins；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.011

重慶市衛(wèi)生局面上項(xiàng)目(2009-2-242)；2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病分會(huì)-安斯泰來(lái)皮膚病學(xué)研究基金

400014重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科

羅曉燕，Email：luoxycq@hotmail.com