頂空氣相色譜法檢驗血液中乙醇含量

張瀅 劉陽

(1.齊齊哈爾大學化學與化學工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾市公安局,黑龍江齊齊哈爾 161005)

頂空氣相色譜法檢驗血液中乙醇含量

張瀅1劉陽2

(1.齊齊哈爾大學化學與化學工程學院,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾市公安局,黑龍江齊齊哈爾 161005)

本文采用頂空進樣方法,通過改進色譜條件,改進數據處理方式,從而建立一個改進的血液中乙醇的檢驗方法,以獲得更好的分離效果和線性關系,解決實際應用中存在的同一個樣品無法重復進樣,標樣存儲和取用的問題。

內標曲線法 頂空氣相色譜 血液中乙醇 相對標準偏差

Headspace sample injection method with improved chromatographic condition and data processing was used in this article, establish an improved detection of alcoholicity in blood, thereby to get a better separation effect and linear relationship. The matter of the same sample can’t be injected repetition, and the matter of samples’ store and access have been solved.

internal standard curve method; headspace gas chromatography alcohol in blood relative standard deviation

乙醇廣泛存在于日常飲用的各種飲品中,可以說是涉及人數最多、應用范圍最廣、濫用程度最高的一種毒(藥)物。長期過量飲酒或慢性酒精中毒可誘發或導致心腦血管疾病、消化系統疾病、精神障礙等多種疾病,甚至導致死亡。飲酒后人的中樞神經活動會變得遲鈍,致使手足活動遲緩、生理機能減退、視力聽力等感知能力降低,還會導致行為異常,從而發生意外甚至犯罪,比如車禍、吸入嘔吐物窒息而死、酒后肇事等[1]。酒后駕駛更是一直以來困擾我們的世界性的社會問題,是造成交通肇事的主要原因[2]。血液中乙醇含量(blood alcohol concentration,BAC)的檢驗在判定飲酒后駕車、飲酒后違法犯罪、飲酒中毒死亡等案事件中起到十分重要的作用。

現階段對于血中乙醇含量的檢測方法主要有化學法、光譜法、電池法、酶學法和氣相色譜法[3,4]。其中頂空氣相色譜法(HS/GC)具有分離效率高、檢測靈敏度高、分析速度快、準確度較高、精密度高、雜質干擾少等諸多優點[5、6],因而在BAC的測定中得到廣泛應用。但是在實際應用中我們發現,實驗過程往往受到同一個樣品無法重復進樣的問題,標樣的儲存和取用問題的困擾。因此,本文著重從上述三個問題入手,力爭可以解決實際操作過程中遇到的這些問題。

圖1 乙醇、叔丁醇的氣相色譜圖

圖2 校正曲線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

藥品試劑:無水乙醇(Sigma-aldrich,色譜純),叔丁醇(Fluka,色譜純)。

儀器設備:頂空進樣器(Agilent 7894E Headspace Sampler);氣相色譜儀(Agilent 6890N GC),GILSON活塞排代式移液器(M1000型),GILSON空氣排代式移液器(P100型)。

1.2 實驗步驟

(1)樣品處理:將無水乙醇標準品配制成10mg/mL的標注樣品貯備液,冷藏備用。

配制2.0mg/mL的叔丁醇溶液,作為內標物,冷藏備用。

精密量取血液樣品500μL,加入10mL頂空瓶,再加入2.0mg/mL的叔丁醇內標液50μL,壓蓋封口,制成待檢樣品,供HS/GC分析。

(2)進樣器條件:樣品瓶溫度70℃,進樣環溫度80℃,傳輸線溫度90℃;

(3)色譜條件:色譜柱DB-ALC1 30m×530μm×3.0μm毛細管柱,柱溫箱100℃(保持8min),載氣N2,流速3.0mL/min;

(4)檢測器條件:火焰光度檢測器(FID),加熱器溫度280℃,氫氣流量40.0mL/min,空氣流量300mL/min。

(5)線性回歸方程:將10mg/mL的乙醇標準貯備液分別稀釋成20mg/100mL、40mg/100mL、80mg/100mL、120mg/100mL、200 mg/100mL、300mg/100mL、400mg/100mL等濃度梯度的標準溶液。每個濃度梯度平行5份,加入內標物溶液,制成樣品進行HS/GC分析。分析所得數據,按照經叔丁醇校正過的乙醇峰面積建立校正表,將校正表保存到色譜方法中,即得內標曲線-頂空氣相色譜法[7]。

2 實際應用中存在的問題

2.1 重復進樣的問題

在實際應用中,時常會發生由于各種原因而造成檢驗血液量采集不足的情況。通過頂空氣相色譜分析的原理[8]可知,頂空瓶內的樣品每進樣一次都會造成濃度的損失,所以不能像直接進樣分析那樣對同一個檢材樣品進行重復進樣分析。而按照要求卻需要平行取樣和留樣備檢,如果檢材的量不足會給檢驗工作帶來很大的困難。

由此我們考慮到:由于每次的進樣量很少,損失量不多,因此按照亨利定律計算,重復進樣分析得到的結果偏差可能不是很大。如果推測成立,則我們雖然不能把通過重復進樣獲得的數據作為檢驗意見的依據,卻至少可以在平行樣品出現數據異常時,對其相對標準偏差(RSD)[9]進行分析,分辨誤差是來自檢材均勻性、檢材處理還是儀器進樣,在檢材極少時進行這樣的操作就很有實際意義。

2.2 標樣存儲的問題

表1 單次進樣與重復進樣檢驗結果

表2 冷藏保存一年的標準溶液與新配制的標準溶液檢驗結果

表3 冷藏的標準溶液與室溫的標準溶液檢驗結果

進口的標準物質購買困難,且價格昂貴。為了保證檢驗的準確性我們又需要定期校準標準曲線,不斷消耗標準溶液。所以,如果儲存在3℃條件下的10mg/mL乙醇標準溶液儲備液,能夠長時間儲存而不發生濃度的變化,就可以緩解標液消耗的難題,也為標準物質存儲相關的研究提供一些借鑒。

2.3 標樣取用的問題

不同溫度下溶液的密度是不同的,那么3℃條件下冷藏備用的叔丁醇內標液或乙醇標準溶液是直接取出使用,還是放置達到室溫(通常是20℃左右)后再使用就成為本文研究的內容之一。

3 結果與討論

3.1 分離效果和線性關系

從圖1可知,本文建立的方法因為采用頂空進樣雜質干擾少,基線平穩;不改變柱溫箱溫度即能將乙醇峰和叔丁醇內標峰很好的分離且峰形良好。恒定溫度還有利于儀器保持平衡,節約分析時間。

由本文方法求得的線性回歸方程如下:

從圖2可以看出,本文方法的線性關系良好,既說明了方法的可用性也說明了采用標準曲線法的準確性。

3.2 單次進樣與重復進樣對比分析

我們對低濃度和中等濃度兩個梯度使用同一個樣品重復進樣3次,與3份平行樣品單次進樣所得數據均列于表1。從表1中的各組RSD值可以看出,同一個樣品重復進樣3次所產生的誤差與3份平行樣品單次進樣之間的誤差并沒有明顯差異,測得的乙醇含量也沒有明顯差別。充分證明重復進樣的操作可以作為一個有用的輔助手段。

3.3 3℃封存1年的標準液與新配制標準液對比分析

取用一定量用封口膜封存在3℃下1年期的10mg/mL乙醇標準溶液儲備液,分別稀釋為20mg/100mL、200mg/100mL兩個級別的標準溶液,與新配制的同等濃度的標準溶液進行對比實驗,實驗數據詳見表2。通過對比各組數據可以看出,儲存1年的10mg/mL的乙醇標準溶液儲備液與新配制的溶液相比沒有明顯的差異,含量沒有損失,數據的穩定性也好,可以繼續使用。

3.4 冷藏標準液與常溫標準液對比分析我們分別用冷藏標液直接制樣和放置至室溫后制樣的方式,對各自濃度為20mg/100mL、200mg/100mL的兩組樣品進行分析,評價其相對標準偏差(RSD),所得數值詳見表3。通過對比各組數據可以看出,冷藏狀態的標準溶液和常溫下的相比,不論各物質的峰面積、最終的含量還是各自的RSD值都沒有明顯的差異,也沒有明顯的變化規律,說明溶液濃度沒有發生明顯變化,因此在日常的檢驗工作中可以將冷藏著的標準溶液取出后直接使用。

4 結語

本文使用頂空氣相色譜法(HS/GC),結合工作曲線法和內標法,既能反應方法的靈敏度和線性相關情況,又能校正儀器、環境等因素造成的誤差,從而改進了內標曲線-頂空氣相色譜分析血液中乙醇含量的方法。此方法不僅能提高定量分析的準確性,還適用于大批量樣品的分析,提高工作效率。運用這一方法對文中提到的幾個問題進行了驗證,得到理想的結果。

[1]白璐,廖林川等.乙醇相關問題的綜合探討[J].刑事技術,2004,2:25-27.

[2]David P. Phillips & Kimberly M.Brewer.The relationship between serious injury and blood alcohol concentration (BAC) in fatal motor vehicle accidents:BAC=0.01% is associated with significantly more dangerous accidents than BAC = 0.00%[J].Addiction,2011,106:1614-1622.

[3]李瓊,謝國明等.血乙醇濃度分析方法及其評價[J].分析儀器,2005,3:57-59.

[4]趙楚,桑向玲,付文輝.乙腈提取法測定血中乙醇含量[J].廣東公安科技,2001,3(63):22-23.

[5]潘靜.頂空氣相色譜法測定全血中乙醇的含量[J].醫學臨床研究,2008,25(6):1088-1089.

[6]劉兆,楊瑞琴等.腐敗血液中乙醇的頂空氣相色譜分析[J].中國司法鑒定,2010,4:26-28.

[7]賀東霞.內標曲線法測定血中乙醇含量的優勢[J].2010,9(2):142-146.

[8]王永華.頂空氣相色譜分析原理與技術[J].中國環境監測,2006,22(2):7-13.

[9]王威,倪春芳等.頂空氣相色譜內標法測定人血中乙醇含量的不確定度評定[J].刑事技術,2009,3:24-27.