SPIO標記濃度對BMSCs生物學特性的影響及體外MRI表現

趙江民，劉佳，林雁冰，宗根林，吳利忠，錢海珊，游建雄*

1.上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院醫學影像科，上海 201999

2.上海市東方醫院醫學影像科，上海200120

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)是一類具有高度的自我復制能力和多項分化潛能的細胞[1-3]。近年來，隨著分子影像學技術的發展，采用適當的分子標記BMSCs，利用MRI成像技術對其示蹤，已成為研究的熱點[4-6]。筆者通過對大鼠BMSCs進行不同濃度超順磁性氧化鐵(SPIO)的體外標記，研究其對干細胞的生物學特性的影響，以及不同標記濃度SPIO的MR成像效果，為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器和試劑

清潔級SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司購入)，4～6周齡5只。

DMEM/F12培養基(美國Gibco公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，MR成像儀(3.0 T，Achieva型)(Phillips公司)，FBS(胎牛血清) (美國Gibco公司)，L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶(1:250) (美國Hyclone公司)，超順磁性氧化鐵(商品名Resovist；德國Schering公司)，普魯士藍染色試劑盒(上海虹橋樂翔醫用試劑公司)。

1.2 大鼠BMSCs的體外分離、培養與傳代

SD大鼠行頸椎脫臼法處死，完整取出股骨、脛骨及肱骨，在超凈臺無菌條件下，用注射器吸取5 ml含15%胎牛血清的完全培養基(DMEM/F12，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)反復沖洗骨髓腔，并用吸管將細胞懸液吹打混勻。將沖出液直接接種于T25的細胞培養瓶內，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。

待細胞融合達80%～90% 即可傳代。用0.25%的胰蛋白酶1 ml消化后按1:2或1:3的比例傳代。以后每隔3～4 d換液，倒置相差顯微鏡逐日觀察，待細胞融合鋪滿瓶底約80%～90%，重復上述操作。

1.3 流式細胞儀檢測表面抗原CD34、CD44及CD90

取培養至第4代的細胞，用PE-CD34、PECD44及FITC-CD90抗體標記，并通過流式細胞儀檢測細胞表型。

1.4 BMSCs的SPIO標記及鑒定

SPIO加入到新鮮DMEM/F12(含15%FBS)細胞培養液中，將SPIO濃度分別調整為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml，并在這些液體中分別加入0.75 μg/ml的多聚賴氨酸。實驗組：取狀態良好的第4代BMSCs分別更換上述4種濃度SPIO的完全培養液，細胞濃度為1×105/ml，置于細胞培養箱(37℃、5%CO2、濕度95%)孵育48 h，作為實驗組(B、C、D、E)。對照組(A)：用不含SPIOPLL的DMEM/F12培養液換液，其他條件同實驗組。并在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態及生長狀況。

將經SPIO標記48 h的實驗組(B、C、D、E)的BMSCs分別進行普魯士藍染色，顯微鏡下觀察結果。計數陽性細胞，計數各孔3個低倍鏡視野下的200個細胞中的陽性細胞，計算陽性細胞比率(陽性細胞比率=陽性細胞數÷細胞總數×100%)。

1.5 SPIO標記的BMSCs生物學特性的檢測

1.5.1 臺盼蘭染色觀察細胞活性

將實驗組及對照組共5組細胞制為細胞懸液，取9滴細胞懸液移入小試管內，加入1滴0.4%的臺盼蘭染液，混勻，在光鏡下進行細胞計數，死細胞染為藍色，活細胞不著色，計數200個細胞，每組重復3次，并計算活細胞百分率(活細胞率=活細胞數÷細胞總數×100%)。

1.5.2 MTT比色法檢測細胞增殖

將實驗組及對照組共5組細胞制成細胞懸液(細胞濃度2×104/ml)，按每孔200 μl接種于96孔板中，每組設10個平行對照孔。分別在接種后第5天采用MTT法進行細胞增殖檢測，酶聯免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6 SPIO標記的BMSCs體外MRI

對照組、各實驗組標記48 h后，將細胞濃度調整為2×106/ml的細胞懸液，每組細胞各取250 μl (細胞量為5×105)接種于96孔板中，進行MR掃描。采用Phillips 3.0 T Achieva型MR成像儀，八通道頭顱線圈(Sense head 8 coil)。視野(FOV) 100 mm×150 mm，層厚0.6 mm，層間距0 mm，矩陣163×163；采用3D-FFE (TR 100 ms，TE 4.6～40 ms，echo 5，Flip 15°)。測量各孔細胞懸液圖像的信號強度，ROI為5 mm×5 mm。相對信號值=標記BMSCs的信號強度÷對照的普通BMSCs的信號強度。

1.7 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析處理，以均數±標準差(±s)形式表示，細胞活性、細胞增殖結果及MRI信號強度比較采用方差分析，以P<0.05表示差別有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs表面抗原的檢測

流式細胞儀檢測表面抗原，表面抗原CD34表達陰性，CD44 、CD90表達陽性的細胞分別在98%、90%左右，表明分離培養得到的MSCs純度較高(圖1)。

2.2 SPIO標記BMSCs

2.2.1 倒置相差顯微鏡下，離心后觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察發現，SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml標記的BMSCs保持原有的梭形形態，在胞質內細胞核周圍可見到聚積的褐色顆粒物。但在75 μg/ml及100 μg/ml SPIO標記后的BMSCs中，雖然部分仍保持原有的梭形形態，但細胞間出現較多的細胞碎片及散在褐色顆粒聚集物，100μg/ml標記的細胞膜模糊、細胞與細胞之間的邊界不清(圖2)。四種濃度SPIO標記48 h后的細胞經胰酶消化離心后，可見沉積的細胞團塊呈現為棕褐色，且隨著SPIO的濃度增加其細胞團塊顏色也逐漸加深(圖3)。

2.2.2 標記效率檢測

SPIO濃度為25、50、75及100 μg/ml標記48h的BMSCs經普魯士藍染色后顯微鏡下觀察，細胞的胞質內均出現成簇或散在分布的細小的藍色鐵顆粒，并隨著SPIO濃度的增加，藍色鐵顆粒有所增多。這4個組標記的陽性細胞率分別為：99%、100%、100%、100%(圖4)。

2.3 SPIO標記BMSCs生物學特性的檢測結果

2.3.1 臺盼蘭染色活細胞計數

25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml濃度的SPIO標記后，經臺盼蘭染色活細胞比率分別為95.51±1.20、96.03±1.78、92.73±0.98和90.44±2.24，未標記BMSCs活細胞比率為95.35±1.37。與未標記組相比， SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml標記的BMSCs活細胞比率差異無統計學意義(P>0.05)，而SPIO濃度為75 μg/ml、100 μg/ml時，活細胞比率差異有統計學意義，P值分別為0.0026、0.0028(P<0.05)，說明對細胞活力有明顯抑制作用。

2.3.2 細胞增殖活性檢測

MTT結果顯示，濃度為25 μg/ml、50 μg/ml的實驗組SPIO標記對細胞增殖無明顯影響；而濃度為75 μg/ml、100 μg/ml的實驗組與對照組相比，明顯抑制細胞增殖，P值分別為0.01663、0.01659(P<0.05；表1)。

2.4 MRI掃描結果

表1 實驗組及對照組的MRI信號強度和吸光度(OD)值(±s)Tab.1 MRI signal intensity and absorbance (OD) value of experimental and control groups(±s)

Note: aP<0.05 compared with control group.

Group Signal intensity Absorbance (OD) value (n=10)Control group 1260.2±145.8 0.4886±0.039125 μg/ml 1005.3±262.5 0.4807±0.035250 μg/ml 711.3±198.3a 0.4701±0.033975 μg/ml 556.5±145.6a 0.4523±0.0423a 100 μg/ml 340.4±102.8a 0.4429±0.0309a

在SPIO標記48h的BMSCs MRI掃描圖像上，當SPIO標記濃度為25 μg/ml時，細胞懸液的信號最高，與對照組BMSCs相比較，信號強度的差異無統計學意義；當SPIO濃度≥50 μg/ml，標記細胞的T2信號強度與對照組BMSCs相比較均有明顯差異(P<0.05)，隨著SPIO濃度的增加信號強度也逐漸降低，當濃度為100 μg/ml時，信號強度為最低信號(表1，圖5)。

3 討論

骨髓間充質干細胞的標記方法眾多，目前，由于磁對比劑標記細胞進行MRI活體示蹤具有非侵襲性、可重復性、動態性等特點，故利用MRI定位及監測移植細胞遷徙情況已成為重要的研究手段[7-8]。其中，超順磁性氧化鐵(SPIO)也已成為應用最為廣泛的陰性對比劑[9]。

3.1 BMSCs 的SPIO標記

圖1 流式細胞儀檢測MSCs表面抗原CD34、CD44及CD90的結果 圖2 A為未標記的BMSCs；B～E分別為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml SPIO標記48 h的BMSCs ( ×100) 圖3 SPIO標記：不同濃度SPIO標記BMSCs 48 h，離心后細胞的團塊 圖450 μg/ml SPIO標記BMSCs48h后普魯士藍染色(A： ×100；B： ×200) 圖5 不同濃度SPIO (μg/ml)標記BMSCs的MR圖像Fig.1 Detection of MSCs surface antigen CD34, CD44 andCD90 by fl ow cytometry. Fig.2 A: unlabeled BMSCs.B—E: BMSCs labeled with different concentration in 25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml and 100 μg/ml after 48 h ( ×100). Fig.3 BMSCs labeled with different concentration of SPIO for 48 h after centrifugation. Fig.4 BMSCs labeled with 50 μg/ml SPIO for 48h after the Prussian blue staining (A: ×100.B: × 200). Fig.5 MR images of BMSC labeled with different concentrations of SPIO (μg/ml).

SPIO的核心結構為氧化鐵顆粒(3～5 nm)，其表面帶有負電荷，由于細胞膜也帶負電荷，因此未經表面修飾的SPIO納米顆粒很難進入細胞內[10-11]。多聚賴氨酸(PLL)(常用轉染劑之一)，其表面帶有正電荷，通過靜電作用與表面帶有負電荷的SPIO顆粒結合，可促進細胞胞吞噬或胞飲，從而提高細胞標記率[12]。本研究采用PLL修飾SPIO，即PLL-SPIO，對干細胞標記的成功率非常高，經普魯士藍染色后發現SPIO濃度分別為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml時體外標記BMSCs的細胞陽性率分別為99%、100%、100%、100%。倒置顯微鏡下及細胞離心后觀察，胞質內細胞核周圍可見到聚積的褐色顆粒物及試管內褐色的細胞團塊，且隨著SPIO的濃度增加其細胞團塊顏色也逐漸加深，再次印證了細胞內的鐵顆粒濃度與加入培養液內的SPIO濃度呈正相關，這與Daldrup-Link等[13]的結果一致。

3.2 SPIO標記對BMSCs生物學特性的影響

雖然SPIO的標記濃度越高，細胞的標記率越高，MR成像的效果會越好，但標記濃度過高會影響細胞的生物學活性及其增殖能力[14]，從而影響到活體成像的追蹤觀察；而適宜濃度SPIO標記BMSCs并不影響體外干細胞的生物學特性及多向分化能力[15-16]。因而選擇適宜的標記濃度至關重要。

本實驗結果顯示，SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml的SPIO標記后的BMSCs生長狀態良好，能夠保持細胞原有的梭形形態，正常貼壁生長并傳代，臺盼蘭活細胞計數實驗及MTT細胞增殖檢測證實標記后的細胞仍具有較高的活性及增殖能力。以上實驗結果與Arbab等[17]及Ben-Hur等[18]研究結果相似。而當SPIO濃度為75 μg/ml和100 μg/ml時，活細胞率分別為92.70%和90.41%，明顯低于對照組，且細胞增殖明顯受到抑制，說明當SPIO濃度過高時會對細胞產生一定的毒性作用。這可能與細胞內非結合的鐵能使氧化作用加強，形成過多的氧化產物和羥基自由基，造成細胞損傷，甚至導致細胞壞死有關[19]。

3.3 體外MRI成像

經SPIO標記BMSCs的MRI成像觀察，證實SPIO主要縮短了T2*及T2弛豫時間，1×103/ml的細胞濃度就能引起明顯的信號變化[20]，且經表面轉染的SPIO標記是觀察所標記干細胞的最有效方法[16]。在本研究MRI上，觀察到SPIO標記48 h的各組細胞懸液的信號強度，與未標記對照組BMSCs相比較，均表現為不同程度的低信號，但SPIO標記濃度為25 μg/ml時，與普通BMSCs相比較，信號強度的差異無統計學意義；當SPIO濃度≥50 μg/ml時，標記細胞的T2信號強度與普通BMSCs相比較均有明顯差異(P<0.05)，隨著SPIO濃度的增加信號強度也逐漸降低，這也說明隨著SPIO標記濃度的增加，進入到細胞內的SPIO也有所增加，產生了更為明顯的負性對比效應，這與Lee等[21]報道一致。

本研究標記方法簡單易行且安全有效，同時MRI能夠探測到干細胞在活體內的分布和遷移[15]。但該方法還存在不足之處：由于MRI只能觀察標記細胞的鐵含量變化，故只能對標記細胞起示蹤依據，不能對標記細胞的定量和定性分析，無法分析細胞的增殖及分化情況，所以影響以后干細胞在體內移植后的觀察價值。相信分子影像技術的運用和標記方法的改進是未來研究的方向。另外Rosenberg等[22]發現SPIO標記hMSCs在缺血缺氧環境下其細胞活性大幅降低，所以該標記方法運用于腦缺血動物模型的影響，有待更多的試驗證實。同時，王建東等[23]發現鐵蛋白與SPIO相互作用，并可以延長MRI活體細胞示蹤時間，克服了SPIO無法長期標記示蹤的缺陷。

總之，本研究通過全骨髓直接貼壁法能在體外成功培養并擴增出大鼠BMSCs，經形態學、分化潛能及流式細胞儀鑒定證實；采用濃度為25～50 μg/ml的SPIO聯合0.75 μg/ml PLL體外標記大鼠BMSCs安全、可靠，不會對細胞的表型、活力和增殖等生物學特性產生明顯的影響；MR掃描在T2WI序列上能有效觀察到濃度為50 μg/ml標記SPIO標記BMSCs 48 h后的信號變化。

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