麻瘋樹籽殼乙醇提取物的抗氧化活性研究

馬 博，張婷婷，劉細祥，李榮峰，農定確

(百色學院化學與生命科學系，廣西百色533000)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻瘋樹籽 購買于廣西南寧富民達生物科技有限公司。麻瘋樹籽去雜除塵后脫仁，籽殼置于電熱鼓風干燥箱內50℃干燥72h，粉碎、過60目篩，石油醚索氏回流脫脂12h、揮干石油醚，將其4℃保藏、備用。

1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)和 2，4，6- 三 吡 啶基-S-三嗪(ferric-tripyridyltiazine，TPTZ)Sigma公司;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(Butylated hydroxytoluene，BHT)(GC，＞99.0%) 阿拉丁公司;蘆丁國藥集團化學試劑有限公司;鄰苯三酚、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、抗壞血酸(VC)、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、石油醚(30～60℃)及檸檬酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2700紫外可見分光光度計 日本島津;FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;TGL-16M高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;HH-S2數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠;DHG-9146A型鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;LD-200中藥粉碎機 長沙常宏制藥機械設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 麻瘋樹籽殼乙醇提取物制備 取麻瘋樹籽殼粉，按照料液比1∶25，溶于70%(V/V)的乙醇溶液中，85℃回流提取2.5h，抽濾，濾液減壓除去乙醇，定容。

1.3.2 麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法繪制標準曲線［5］。分別精密量取0.2mg/mL蘆丁溶液(30%乙醇制)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置入 25mL 容量瓶中，各加1.0mL 5%的NaNO2溶液，混勻后靜置6min;再各加1.0mL 10%的Al(NO3)3溶液，混勻，靜置6min;最后各加10mL 4%的NaOH溶液，混勻，30%乙醇溶液定容，靜置15min。以空白試劑為對照，在510nm處測定各自吸光度，再以吸光度(A)為縱坐標、以蘆丁的不同質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，所得回歸方程為Y1=10.993x-0.0005，R2=0.9998，線性范圍為8～40μg/L。取1.0mL麻瘋樹籽殼乙醇提取液，置入25mL容量瓶中，按照上述方法進行測定總黃酮提取液的吸光度，并代入回歸方程，求出麻瘋樹籽殼乙醇提取液中總黃酮的質量濃度。代入公式(1)計算麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮的含量。

式中，R為總黃酮含量(%);c為提取液中黃酮濃度(mg/mL);v為黃酮提取液體積(mL);n為稀釋倍數;m為麻瘋樹籽殼質量(g)。

1.3.4 DPPH自由基清除實驗 DPPH·是一種較為穩定的以氮為中心的芳香族自由基，其醇溶液呈紫色，在517nm處有特征峰。抗氧化劑通過傳遞電子或氫原子來中和DPPH·，使其在517nm下吸光度下降，進而評價供試物抗氧化能力。按照參考文獻［7］，稍作修改。6.5mmol/L的DPPH溶液(無水乙醇配制)4.0mL，加無水乙醇1.0mL，混勻、反應40min后，于517nm測吸光度，記錄為A0;用不同黃酮質量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液代替1.0mL無水乙醇，其余步驟同上，于517nm測吸光度，記錄為 A1;用4.0mL無水乙醇代替DPPH溶液，并用不同黃酮質量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液代替無水乙醇，混勻、反應 40min后，于 517nm測吸光度，記錄為 A2。DPPH·清除率 η3(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100。

1.3.6 還原力的測定實驗 采用普魯士藍法。按照參考文獻［6］，稍作修改。取2.5mL不同黃酮質量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液，加入0.2mol/L的PBS(pH6.6)2.5mL，混勻，再加入 1%(m/V)的 K3Fe(CN)62.5mL，混勻，50℃水浴20min后，再加入10%(V/V)三氯乙酸 2.5mL，混勻，3000r/min離心10min，取上清液5mL加入0.1%的FeCl3溶液1mL，后用蒸餾水補至10mL，混勻并靜止10min，在700nm處測吸光值。

1.3.7 總抗氧化能力實驗 采用鐵離子還原/抗氧化能力分析法(Ferric reducing/antioxidant Power，FRAP)法［10］。先用 0.04mol/L 的 HCl溶液配制0.01mol/L的TPTZ溶液，然后與0.3mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH3.6)、0.02mol/L 的 FeCl3溶液按照 10∶1∶1的體積比混合得到TPTZ工作溶液。再分別取不同黃酮質量濃度的麻瘋樹籽殼乙醇提取液0.1mL，加入1.8mL預熱至37℃的FRAP工作液，用蒸餾水補至5mL，混勻，37℃下反應20min，于593nm處測定其吸光度，并在FeSO4標準曲線上查得FRAP值(以mmol/L的Fe2+表示)。用不同摩爾濃度FeSO4溶液代替麻瘋樹籽殼乙醇提取液，其余操作同上，以吸光度為縱坐標，以不同摩爾濃度FeSO4為橫坐標，標準曲線繪制。

1.4 數據統計與分析

利用SPSS13.0軟件包進行數據統計分析，并借助Excel 2003進行作圖。

2 結果與分析

2.1 麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮的測定

麻瘋樹籽殼乙醇提取物中總黃酮含量為6.61%。

2.2 超氧陰離子清除作用

圖2 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對超氧陰離子的清除作用Fig.2 Scavenging activity of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell on superoxide anion radicals

2.2 DPPH自由基清除作用

由于DPPH·實驗敏感性強、重現性好、操作簡單、短時內能做多個樣品，目前已被廣泛用于評價抗氧化劑的抗氧化性能［10-11］。由圖3所示。在質量濃度0.05～0.3mg/mL范圍內，麻瘋樹籽殼乙醇提取物和BHT對DPPH·清除率都隨質量濃度的增大而增加，而后二者清除率均不再顯著增加。另外，從質量濃度0.2mg/mL起，麻瘋樹籽殼乙醇提取物的DPPH·清除率大于BHT，但麻瘋樹籽殼乙醇提取物的DPPH·清除率在測定濃度范圍內明顯均低于VC。麻瘋樹籽殼乙醇提取物的黃酮半數抑制濃度(IC50)為0.185mg/mL，大于VC的0.085mg/mL，略低于BHT的0.186mg/mL，可見麻瘋樹籽殼乙醇提取物具有較強的DPPH·清除能力。

圖3 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging activity of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell on DPPH radicals

2.3 亞硝酸鹽清除作用

亞硝胺是已知致癌性最強的化學物質之一，它可由亞硝酸鹽和胺類在人及動物的胃中合成。因此，清除體內亞硝酸鹽是防止癌癥的重要途徑。結果表明，NaNO2的回歸方程為Y2=0.1151x+0.0616，R2=0.9966，線性范圍為5～20mg/L。由圖4可知，在測定的黃酮質量濃度范圍內，麻瘋樹籽殼乙醇提取物的亞硝酸鹽清除率與其黃酮質量濃度密切相關，其半數抑制濃度(IC50)為0.494mg/mL，大于 VC的0.115mg/mL，但其黃酮質量濃度超過0.5mg/mL后，其亞硝酸鹽清除率開始高于BHT，而BHT清除率在測定范圍內均小于50%。當麻瘋樹籽殼乙醇提取物中黃酮的質量濃度為1.0mg/mL時，其清除率達到81.63%。由此說明麻瘋樹籽殼乙醇提取物具有較強的亞硝酸鹽清除能力。

圖4 麻瘋樹籽殼乙醇提取物對亞硝酸鹽的清除作用Fig.4 Scavenging activity of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell on nitrite

2.4 還原力

抗氧化劑通過自身還原作用供給電子而使自由基變為穩定分子，失去活性，故還原力是反映抗氧化劑提供電子能力的重要指標。待測物的還原力與吸光度大小相關，吸光度越大，還原力越強，抗氧化性越強，還原力可通過待測物吸光度大小來表示［10］。由圖5可知，麻瘋樹籽殼乙醇提取物中黃酮的質量濃度在0.1～0.5mg/mL范圍時，其吸光度與質量濃度之間存在劑量依賴關系;在0.7～1.0mg/mL范圍時，其吸光度基本穩定，并與同質量濃度的對照VC吸光度相當;當麻瘋樹籽殼總黃酮質量濃度超過0.3mg/mL時，其吸光度大于BHT。可見麻瘋樹籽殼乙醇提取物在高質量濃度下具有較強的還原力。

圖5 麻瘋樹籽殼乙醇提取物的還原力Fig.5 Reducing power of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell

2.5 總抗氧化能力

FRAP作為最簡單、快速、廉價的常規分析方法之一，目前已發展成一種直接測定供試物抗氧化能力的方法［11］。結果顯示，FeSO4的線性回歸方程為Y3=2.2045x+0.0935，R2=0.9999，線性范圍為 0.025～0.8mmoL/L。麻瘋樹籽殼乙醇提取物的抗氧化能力如圖6所示。在測定濃度范圍內，其FRAP值隨著質量濃度增加而增強，且均大于BHT而小于VC。在麻瘋樹籽殼乙醇提取物的黃酮質量濃度為1.0mg/mL時，其FRAP值為1.08mmol/L，表明麻瘋樹籽殼乙醇提取物具有較強的抗氧化能力。

圖6 麻瘋樹籽殼乙醇提取物的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant ability of ethanol extracts from Jatropha curcus L.seed shell

3 結論

［1］全治國，趙靜峰，羊曉東，等.小桐子的化學成分及藥理作用研究進展［J］.云南化工，2009，36(2):39-43.

［2］李玲，李曉帆，吳慧星，等.麻瘋樹種子中抗氧化活性成分的研究［J］.中草藥，2010，41(12):1932-1936.

［3］馬博，蘭翠玲，李力，等.麻瘋樹籽粕飼用品質改良及其深加工技術研究進展［J］.中國油脂，2011，36(5):26-30.

［4］劉細祥，馬博，張婷婷，等.響應面法優化麻瘋樹籽殼總黃酮工藝的研究［J］.食品工業科技，2014，35(6):284-287，291.

［5］張婷婷，馬博，李榮峰，等.桂西野生蕨菜黃酮提取工藝的研究［J］.北方園藝，2013，16:163-165.

［6］宣麗，劉長江.不同提取方法對軟棗獼猴桃多糖單糖組成及抗氧化活性的影響［J］.天然產物研究與開發，2013，25:1260-1265.

［7］郭峰，岳永德，湯峰，等.用清除有機自由基DPPH法評價竹葉提取物抗氧化能力［J］.光譜學與光譜分析，2008，28(7):1578-1582.

［8］李利華.馬鈴薯塊莖粗多分體外抗氧化活性［J］.食品與發酵工業，2013，37(9):176-179.

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