大腸桿菌抗氧化基因突變對內源過氧化氫的影響

李 欣，楊麗鵬，杜 琳，喬家駒，尤曉顏，劉云宏，張 敏，張玉先，王利平

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471023)

H2O2是國標允許在食品中應用的食品漂白劑和抗菌劑，主要應用于小麥粉、食用油、蛋白等［1］。同時，H2O2在食品中也廣泛存在，如在水果的成熟、衰老和果皮褐變作用過程中，H2O2扮演重要角色［2］。特別是在農產品儲藏過程中，H2O2對其儲藏品質有著重要影響，直接涉及到食品的自身酸敗和褐變問題程度［3-7］。那么如何控制食品H2O2水平便成為一急需解決的問題。本實驗室的研究發現，H2O2與很多相關酶作用有關，我們可以通過加強對H2O2的了解，進而嘗試尋找控制H2O2產生機制的更為有效的手段，為食品品質保證提供基礎參考數據。

H2O2是活性氧的一種，是細胞有氧代謝的產物［8-9］。H2O2作為機體對外界脅迫反應的調節因子，它可選擇性的誘導許多相關基因的表達，以提高其自身的免疫能力［10］。但是，H2O2含量過多機體出現生理功能失衡、代謝紊亂等中毒癥狀，機體就會遭受極大威脅［11-12］。活性氧快速、短暫的積累的意義在于引發局部壞死，構建自身的防御體系［13-16］。因此，細胞內源H2O2的調控及其機制的研究具有重要的意義。

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)胞內通過生物膜電子傳遞鏈以及多種氧化還原酶系調控H2O2等活性氧的釋放［17］。已有研究證明OxyR可以識別細胞內高水平的H2O2，是細菌抗氧化代謝系統主要的轉錄調控蛋白［18］;烷基過氧化物酶基因ahpC/F的轉錄受到OxyR的正調控［19-20］;單功能的過氧化氫酶KatE和超氧化物歧化酶SodS作為重要的抗氧化酶在排毒方面發揮了至關重要的作用［21-22］。因此，為了闡明離體條件下抗氧化基因 ahpC/F、katE/G、oxyR ahpC/F、sodA/B在降解H2O2方面的作用，揭示E.coli抗氧化系統的作用機制，本研究選用E.coli抗氧化基因的突變體菌株為實驗材料，能夠為其它細菌內源H2O2的調控機制提供指導性的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

E.coli雙基因(ahpC/F)缺失突變體菌株JI370、雙基因(katE/G)缺失突變體菌株 JI367、三基因(oxyRahpC/F)缺失突變體菌株LC74、雙基因(sodA/B)缺失突變體菌株AS240以及野生型菌株MG1655美國伊利諾伊大學微生物系James A.Imlay教授饋贈。將凍干保存的上述菌株取干粉接種到無菌水中混勻，靜置30min后取20μL移接到LB液體培養基中，37℃振蕩培養至菌液混濁，用終濃度為30%的甘油保存菌種，備用［22］。

LB液體培養基配方:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L。

1.2 主要試劑和儀器

30%(V/V)的H2O2、磷酸鉀、辣根過氧化物酶、溴酚紅 洛陽市奧科化玻儀器公司;氯化鈰 Sigma公司，UK;透射電子顯微鏡 TEM100C，JEOL，Tokyo;Hitachi F-4500熒光分光光度計 深圳市昊光機電科技應用有限公司;UV-2800AH紫外分光光度計 杭州匯爾儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 E.coli抗氧化基因突變株過氧化氫酶活性測定 用紫外分光光度法測定酶活。有氧條件下，大腸桿菌生長到至少四代，取對數期的菌懸液稀釋至109CFU·mL-1，然后接種于固定體積的液體培養基中，保證初始菌株生長狀態一致，取不同生長時間的菌懸液離心收集菌體，用室溫50mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)重懸菌體沉淀，用上述緩沖液洗兩次，重懸至菌體至420nm處OD值為0.1。在磷酸鹽緩沖體系中外加H2O2至終濃度為2mmol/L，一定時間間隔(30s)檢測A240變化，每分鐘A240降低值為過氧化氫酶活性［23］。

1.3.2 E.coli抗氧化基因突變株內源H2O2水平檢測 采用熒光法:按照Seaver和Imlay的［15］方法進行H2O2濃度定量測定。實驗中取對數期的菌懸液稀釋至109CFU·mL-1，然后接種于固定體積的液體培養基中，特定時間取同等量的菌液測H2O2釋放量。

1.3.3 過氧化氫的電鏡組織化學法定位(氯化鈰-CeCl3法) 采用組織化學的方法對E.coli的內源H2O2積累進行檢測［24］。37℃培養至對數期，離心收集菌體，用含5mol/L氯化鈰(CeCl3)的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸并在37℃下預處理溫育1.5h。細胞中的H2O2積累可以被CeCl3(Sigma，UK)特異染色，并且按照Bestwick等［25］的方法通過檢測鈰過氧化物的沉積物判斷過氧化氫的積累位點。過氧化氫特異染色后離心收集菌體，棄去含殘余CeCl3的上清液，3%戊二醛重懸細胞4h以上，離心沉淀菌體。經OsO4后固定、環氧樹脂包埋后切片，用透射電子顯微鏡在80kV電壓下觀察(TEM100C，JEOL，Tokyo)。處理對照細胞時，不加入CeCl3對細胞中的過氧化氫染色，后續處理與染色細胞相同。對鈰過氧化物沉積密度設定了4個等級:0，無特定部位的沉積;1，微弱并不連續的沉積;2，從不連續到連續的清晰沉積;3，大量的沉積。

1.3.4 E.coli抗氧化基因突變株生長曲線繪制 參照文獻［26-27］的方法，測定細菌培養液的光吸收值(OD420)，分析細菌的離體生長動態。實驗中取對數期的菌懸液稀釋至109CFU·mL-1，然后接種于固定體積的液體培養基中，保證初始菌株生長狀態一致。

1.3.5 統計學分析 用SPSS11.5進行統計學分析。獨立樣本間的差異顯著性分析用Nonparametric Tests，包括 Mann-Whitney Test、Moses Test、Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test和Wald-Wolfowitz Test。不同基因突變造成的差異顯著性用pairedsample T test分析。結果分為顯著(p＜0.05)和極顯著(p＜0.01)。

2 結果與分析

2.1 抗氧化基因突變對過氧化氫酶活性的影響

為了明確抗氧化基因突變對過氧化氫酶活性的影響，檢測了大腸桿菌不同突變體菌株8～40h過氧化氫酶活性的變化。結果顯示，所有菌株過氧化氫酶活性隨著接種時間的延長不斷升高。突變株LC74的過氧化氫酶活性一直低于野生型;8h時，突變株AS240過氧化氫酶活性低于野生型，8h之后，過氧化氫酶活性高于野生型;8h及之后，突變株JI367和JI370的過氧化氫酶活性高于野生型;16h之后，各菌株過氧化氫酶活性呈現一個規律性的變化，即JI367＞AS240＞JI370＞MG1655＞LC74。

圖1 大腸桿菌突變體菌株的酶活曲線Fig.1 The enzyme activity change cures of E.coli strains JI370，JI367，LC74，AS240 and MG1655

內源H2O2變化曲線顯示，在細菌的整個生長周期中內源H2O2的濃度隨著生長時間的延長不斷增加，抗氧化基因katE/G、ahpC/F、sodA/B分別缺失的突變株 JI367、AS240、JI370，其內源 H2O2水平均低于野生型，而抗氧化基因oxyRahpC/F缺失的突變株LC74在生長到20h以后內源H2O2水平顯著高于野生型(p＜0.05)。不同的抗氧化基因突變株內源H2O2水平相差較大，突變株LC74內源H2O2產生水平最高，可達到30μmol/L，與野生型相比差異極顯著(p＜0.01)，突變株JI370次之，JI367和AS240突變株內源H2O2水平濃度最高時可達到15μmol/L，與野生型相比差異顯著(p＜0.05)。

圖2 大腸桿菌突變體菌株H2O2產生曲線Fig.2 Hydrogen peroxide production curves of E.coli strains JI370，JI367，LC74 and AS240

2.2 組織化學染色法定位細菌內源H2O2

透射電子顯微鏡下觀察結果顯示5個被檢菌株的H2O2水平有顯著差異。圖3結果顯示:MG1655細胞經過染色后H2O2主要積累在細胞壁上且連續清晰(等級2)，質膜和胞質等其它位點沒有檢測到H2O2的積累;突變株LC74內源H2O2在細胞壁上大量積累，細胞質上也能明顯的觀察到H2O2的積累，水平遠遠高于其它菌株(等級3);JI370可清晰觀察到細胞壁上連續的H2O2積累(等級2);AS240中可觀察到H2O2在細胞壁上微弱不連續的沉積(等級1);JI367內源H2O2積累較少，不能明顯的觀察到(等級0)。

2.3 抗氧化基因突變對E.coli生長的影響

圖3 大腸桿菌內源過氧化氫的沉積Fig.3 Endogenous hydrogen peroxide accumulation in wild type and mutant strains of E.coli

E.coli抗氧化基因突變對細菌生長的影響如圖4所示，通過圖表可以看出，E.coli突變株的生長曲線與野生型相比差異較大。突變株LC74與野生型一樣有較明顯的遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期，但是突變體在對數期后期菌量高于野生型，可以推斷出此時胞內H2O2的濃度(約5.4μmol/L)就是促進細菌生長的臨界最低濃度，而當其到達穩定期時菌體量大約是野生型的1.2倍，說明突變株的生長速度受到促進或者裂解速度比野生型慢;其它三種突變株則都沒有明顯的穩定期，對數期過后直接進入衰亡期，說明這些突變株在衰亡期的裂解速度非常快，JI367生長周期最短，其次是AS240，再次是JI370。

圖4 大腸桿菌突變體的生長曲線Fig.4 The growth curves of E.coli strains JI370，JI367，LC74，AS240 and MG1655

3 結論與討論

烷基過氧化物還原酶(alkylhydroperoxide reductase，Ahp)、過氧化氫酶(CAT)以及超氧化物歧化酶(SOD)是細胞內活性氧清除系統中的重要酶類，胞內的H2O2水平由上述三種酶相互協調作用，共同調控［28］。結果顯示，與野生型相比，大腸桿菌突變株JI367、JI370和AS240的過氧化氫酶活性升高，內源H2O2的濃度降低;而突變株LC74過氧化氫酶活性降低，內源H2O2的濃度升高(圖1和圖2)。推測ahpC/F、katE/G基因突變后直接影響到Ahp和CAT酶的活性，內源H2O2的濃度本應下降，但是在OxyR調控子的作用下，其他酶活性補償性的升高，因此造成內源H2O2的濃度降低;而當oxyR基因突變時，直接導致下游的CAT活性降低，H2O2濃度降低;sod基因突變導致SOD酶不能正常歧化超氧陰離子，對應產生的H2O2含量就會降低。Imlay教授等研究者的結論也與此相符［28-29］。由此可說明OxyR作為一個全局性的轉錄調控因子在調控細胞內抗氧化酶之間的補償性表達中起到了至關重要的作用。不同細菌中不同抗氧化酶的作用是不同的，在E.coli中抗氧化酶Kat、Ahp和Sod在降解內源H2O2能力方面所起的作用不同，Ahp起主要作用，Sod次之，Kat最小。

正常生理條件下，細胞內H2O2的濃度維持在一定范圍內，并且隨著生長時間的延長H2O2的濃度也會不斷的增加(圖2)。熒光法及組織化學染色法均檢測到內源H2O2的產生(圖2和圖3)，無論透射電子顯微鏡的觀察結果還是熒光法的定量檢測結果均顯示，H2O2在細胞中普遍存在，不同菌株內源H2O2的水平有所差別。E.coli細胞中H2O2的積累主要定位在細胞壁，當胞內H2O2量足夠多時也會在細胞質中積累(圖3)。

E.coli抗氧化基因 katE/G、ahpC/F、sodA/B可能與延滯期氧化物質的降解有關，它們缺失后使細菌總量在延滯期下降，從而導致后期細菌的生長緩慢;而抗氧化基因oxyRahpC/F缺失使細菌總量在指數生長期后期升高，從而促進了后期細菌的生長(圖4)，當oxyRahpC/F三突變株LC74中內源H2O2的濃度大于約5.4μmol/L時能促進細菌生長(圖4和圖2)。可見，細胞內適量H2O2的積累對于細菌生長是有積極作用的。本實驗探討OxyR與其調控的katE/G、ahpC/F、sodA/B基因之間的協同作用，為深入研究細菌內源H2O2的代謝及其調控機制提供了科學依據，也為進一步闡明動植物細胞中活性氧代謝機制奠定基礎。

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