優化絮凝復合菌在馬鈴薯淀粉廢水中培養及資源化處理條件的研究

張懷予，彭 濤，馬文錦，張小燕，陳興葉，殷 欣，路宏科，金 紅，楊旭星

(甘肅省輕工研究院，甘肅蘭州730000)

甘肅省是我國馬鈴薯主產區之一，總產量位居全國第一，馬鈴薯淀粉的加工是我省的主導產業［1］。馬鈴薯淀粉加工中，平均每生產1t淀粉需消耗6.5t左右的馬鈴薯，排放20t左右的廢水，廢水含有大量糖類、蛋白質、礦物質等，CODCr通常 8000～30000mg/L，蛋白質含量在 2000～8000mg/L［2］。若此廢水直接排放不僅污染水體，且浪費資源。研究一種快速、高效、低耗的淀粉廢水處理方法則是當務之急。我國薯類淀粉行業廢水處理方法主要有生物法和絮凝沉淀法［3］。生物處理法一般分為耗氧和厭氧生物法，運行時必須幾種工藝方法串聯使用。該工藝不僅占地面積大，能耗大，而且運行成本高，處理周期長，易受環境條件影響。絮凝沉淀法成本較低、工藝簡單、適應性強，尤其能降低薯類淀粉廢水的濁度和色度，去除多種高分子有機物而被廣泛采用［4-5］。絮凝劑是整個處理技術的關鍵，決定著廢水處理的效果，常用無機、有機和微生物絮凝劑(Microbial flocculants，MBF)［6-7］。傳統絮凝劑在使用中具有不安全性、對環境造成二次污染等缺點，在許多領域已禁止或限量使用［8-9］。而MBF是由微生物產生并具有絮凝活性的代謝產物，主要有糖蛋白、多糖、蛋白質、纖維素和DNA以及有絮凝劑活性的菌體等［10-12］，是具有應用范圍廣、絮凝活性高、安全無毒、無污染、能自然降解、脫色效果獨特等特點的新一代絮凝劑［13-14］，且多種微生物組成復合菌群后，通過共生、協調作用所產絮凝活性將會比單一菌株所產絮凝效果更好，對環境變化的適應性也更強［15-16］。另外，生產菌的種類繁多、生長快，更易實現工業化。

本研究擬在馬鈴薯淀粉廢水中優化絮凝復合菌的培養和將其用于廢水處理的絮凝條件。實驗將薯類淀粉廢水處理的生物法和絮凝沉淀法結合，處理后回收的絮凝沉淀物質還可以作為動物飼料添加劑進行綜合利用，旨在提高馬鈴薯淀粉廢水的利用率和提供資源化處理廢水的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯淀粉廢水 甘肅薯界淀粉集團有限公司;牛肉浸膏(生化試劑) 上海乳品廠;高嶺土、硫酸亞鐵、硝酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、乙醇、磷酸氫二鉀、氯化鈣 均為分析純;供試菌株 甘肅省輕工研究院食品發酵室篩選的 N1短桿菌(Brevibacterium sp.)和 N2短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)組成;牛肉膏蛋白胨培養基 牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，pH7.0～7.2，水 1000mL，121℃滅菌20min。保藏、復壯菌株時則采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，復合菌構建選用牛肉膏蛋白胨液體培養基。

恒溫搖床 上海天呈科技有限公司;培養箱 上海精密儀器儀表公司;高壓滅菌鍋 上海茸研儀器設備有限公司;pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;電子天平 奧豪斯國際貿易有限公司;7200型分光光度計 上海合利儀器有限公司;UV756CRT紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;PB203-N型分析天平 Metler-Toledo公司;六聯攪拌器 武漢市梅宇儀器有限公司;XSP-10C顯微鏡 上海光學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化復壯 菌株復壯參照純種分離法，4℃保存試管中分別挑取1環菌種，連續兩次經劃線或梯度稀釋轉接于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，30℃培養 72～96h，得到純菌落［17］。

1.2.2 構建復合菌 分別挑取復壯菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養基中培養24h，取1mL各菌懸液按等體積進行復配，于30℃ 150r/min液體發酵培養48～72h 形成復合菌液［18］。

1.2.3 馬鈴薯淀粉廢水培養絮凝復合菌營養條件的優化 以馬鈴薯淀粉廢水為主要培養基質，30℃150r/min搖床培養48h，高嶺土絮凝率為測定指標，通過單因素分析實驗，確定添加碳源、氮源、無機鹽種類和濃度，以及初始pH對復合菌培養的影響，每個實驗2個平行。

1.2.3.1 碳源種類和投加量對絮凝率的影響 在未添加營養物質的廢水中分別添加1g的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉及1mL的無水乙醇、甘油作為外加碳源，定容至100mL于300mL三角瓶中，加入1mL復合菌液發酵培養，分別測定絮凝率，并以不加碳源的廢水為對照。

在100mL的廢水中對選出的碳源，按照單因素法以絮凝率為指標，確定其最佳投加量。

1.2.3.2 氮源種類和投加量對絮凝率的影響 在廢水中(補充確定了種類和投加量的碳源)分別添加0.1g 尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CI、蛋白胨、酵母膏，定容至100mL于300mL三角瓶中，加入1mL復合菌液發酵培養，考察其對絮凝率的影響，并以不加氮源的廢水為對照。

在100mL補充了碳源的廢水中對選出的氮源，按照單因素法以絮凝率為指標，確定其最佳投加量。

1.2.3.3 無機鹽種類和投加量對絮凝率的影響 在廢水中(補充確定了種類和投加量的碳源、氮源)分別添加 0.05g NaCl、KH2PO4、FeSO4、KCl、MgSO4，并定容至100mL于300mL三角瓶中，加入1mL復合菌液發酵培養，考察其對絮凝率的影響，并以不加無機鹽的廢水為對照。

在100mL補充了碳源、氮源的廢水中對選出的無機鹽，按照單因素法以絮凝率為指標，確定其最佳投加量。

1.2.3.4 不同初始pH條件下培養復合菌對絮凝率的影響 在100mL廢水中(補充確定了種類和投加量的碳源、氮源、無機鹽)分別調節初始 pH為4、5、6、7、8、9，進行發酵培養，考察其對絮凝率的影響。

1.2.3.5 優化營養條件 依據單因素實驗結果，以主要影響因素乙醇、NH4NO3、KH2PO4和pH為考察因素，分別選取3個水平，高嶺土絮凝率為指標，通過L9(34)正交實驗設計，對馬鈴薯淀粉廢水培養復合菌的營養條件進行優化，以確定最佳培養方案，因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 馬鈴薯淀粉廢水中絮凝條件的優化 通過單因素分析實驗，確定馬鈴薯淀粉廢水所培養的絮凝復合菌投加量、廢水pH、助凝劑種類和濃度、沉降時間和攪拌速度對馬鈴薯淀粉廢水COD去除率影響，每個實驗重復2次。

1.2.4.1 復合菌投加量對COD去除率的影響 將最適營養條件下發酵培養的復合菌，分別按0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2mL 添加，并加入 3mL 1%CaCl2溶液，廢水定容至100mL，140r/min攪拌5min，靜置10min，測定對COD去除率影響。

1.2.4.2 廢水不同pH對COD去除率的影響 添加1mL的廢水培養復合菌、3mL 1%CaCl2溶液，用廢水定容至100mL，并調節 pH 為3、4、5、6、7、8、9，140r/min攪拌5min，靜置10min，測定對COD去除率影響。

1.2.4.3 助凝劑種類和濃度對COD去除率的影響 添加1mL的廢水培養復合菌，300μL 1mol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、AlCl3溶液，用廢水定容至100mL，140r/min 攪拌 5min，靜置 10min，測定COD去除率影響。

確定了助凝劑種類后，按照單因素法以COD去除率影響為指標，確定其最佳投加量。

1.2.4.4 沉降時間對COD去除率的影響 加入1mL的廢水培養復合菌和3mL 1%CaCl2溶液，用廢水定容至100mL，140r/min 攪拌5min，分別靜置5、10、15、20、25、30min后，測定對COD去除率影響。

1.2.4.5 攪拌速度對COD去除率的影響 加入1mL的廢水培養復合菌和3mL 1%CaCl2溶液，用廢水定容至100mL，分別在 100、140、180、220、260、300r/min條件下攪拌，靜置10min，測定對COD去除率影響。

1.2.4.6 響應面優化實驗 在單因素實驗基礎上，根據Box-Behnken實驗設計原理，選擇對絮凝效果影響較大的3個因素為自變量，即絮凝復合菌投加量、助凝劑CaCl2用量、攪拌速度，以COD去除率為響應值，利用響應面實驗設計對馬鈴薯淀粉廢水的絮凝條件進行優化，以確定最佳絮凝沉淀方案，因素水平表見表2。

表2 響應面實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.5 絮凝效果分析 在最佳絮凝沉淀條件下，對馬鈴薯淀粉廢水進行資源化處理，測定廢水的COD和濁度值，并回收粗蛋白物質。

1.2.6 測定方法

1.2.6.1 絮凝率 于蒸餾水中加入1mL菌發酵液、3mL 1%CaCl2溶液、0.5g高嶺土定容至 100mL，300r/min攪拌 0.5min，140r/min攪拌 5min，靜置10min，以不加絮凝劑的高嶺土懸濁液為對照，注射器吸取上清液液面下1cm處液體測其OD550吸光度值［19-20］。

A:為對照所測吸光度值;B:加入絮凝劑樣品的吸光值;絮凝率:表示投加絮凝劑前后，水樣中懸浮物去除率。

1.2.6.2 COD去除率 于馬鈴薯淀粉廢水中加入1mL絮凝劑溶液、3mL 1% CaCl2溶液，定容至100mL，并用攪拌器于 140r/min攪拌 5min，靜置10min，以馬鈴薯淀粉廢水溶液為對照，吸取上清液，測定絮凝后廢水溶液的COD，計算COD去除率［21］。

A:為對照所測COD值;B:加入絮凝劑樣品的COD值。

1.2.6.3 馬鈴薯淀粉廢水水質及粗蛋白物質的測定 化學需氧量(COD)測定方法同GB 11914-89《水質化學需氧量的測定重鉻酸鉀法》［22］;懸浮固形物含量(SS)采用干燥恒重法測定［19］;總氮(TN)測定方法同HJ 636-2012《水質 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》［23］;總磷(TP)測定方法參照GB 11893-89《水質總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》［24］;pH 采用酸度計測定。

粗蛋白物質的測定方法參照GB/T 6432-94《飼料中粗蛋白測定方法》［25］。

1.3 數據處理

正交分析采用DPS 7.05處理軟件，響應面分析采用Design-Expert 8.0.6設計軟件。

2 結果與討論

2.1 馬鈴薯淀粉廢水培養絮凝復合菌營養條件的優化

2.1.1 馬鈴薯淀粉廢水水質分析 為了充分利用廢水培養復合菌產生高效的絮凝活性物質，則測定馬鈴薯淀粉廢水的水質。如表3所示，廢水中含有大量的有機物質，其中COD為8537mg/L，SS為221mg/L，TN為756mg/L，TP為92.1mg/L，并偏酸性，為微生物提供了良好的生長環境，也嚴重超過了國家標準GB 25461-2010《淀粉工業水污染物排放標準》，必須經過有效治理，方可進行排放。

表3 馬鈴薯淀粉廢水水質特征Table 3 Characteristics of potato starch wastewater

2.1.2 營養條件的優化

2.1.2.1 營養條件種類、投加量及pH對絮凝率的影響 在馬鈴薯淀粉廢水中添加不同碳源后，結果如圖1A所示，6種碳源均能被復合菌利用，其中以乙醇和蔗糖為碳源時，所產微生物的絮凝活性較高，絮凝率分別達到82.01%和71.87%，之后為葡萄糖、淀粉、甘油和果糖，分別為 49.27%、32.15%、28.13%和18.17%。當廢水添加最佳碳源乙醇后，結果如圖1B所示，隨著添加量的增加，絮凝率呈單峰變化趨勢，當投加量增加至1.5mL/100mL時，絮凝率達到最大值88.10%，之后則迅速下降，表明碳源濃度對微生物的培養和絮凝劑的產生在1～2mL/100mL之間為最佳范圍。

在補充1.5mL/100mL乙醇為碳源后，分別在廢水中添加不同種類的氮源，結果如圖1C所示，6種氮源均能被復合菌所用，其中以添加硝酸銨對復合菌產絮凝劑的絮凝效果影響最顯著，絮凝率達到89.36%，之后依次為氯化銨、蛋白胨、硫酸銨、尿素、酵母膏，絮凝率分別為82.55%、78.31%、64.20%、55.59%、53.88%。圖1D表明隨著NH4NO3添加量的增加，復合菌產絮凝劑的絮凝率先增高，當添加量為0.2g/100mL時，達最大值90.62%，之后則開始迅速下降，表明氮源過高或過低都不利于復合菌產絮凝劑。

圖1 營養條件種類、投加量及pH對絮凝率的影響Fig.1 Effects of different additional nutrition sources，dosages and pH on flocculating activity

圖1E結果顯示，在補充了1.5mL/100mL碳源乙醇和0.2g/100mL氮源NH4NO3的廢水中，添加5種無機鹽后，對絮凝活性均有影響，其中絮凝效果最好的為磷酸二氫鉀，絮凝率達到91.84%，其次為硫酸亞鐵，絮凝率為82.42%，之后則為氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂，絮凝率分別為70.11%、63.62%、62.31%。之后廢水中添加KH2PO4，圖1F表明隨著KH2PO4含量的增加，復合菌產絮凝劑的絮凝率逐漸升高，添加至0.4g/100mL時，絮凝效果最佳，達到92.33%，之后開始下降，由此顯示KH2PO4投加量的最佳范圍為0.3～0.5g/100mL。

作為培養基的馬鈴薯淀粉廢水初始pH對復合菌產絮凝劑的絮凝率影響較大，圖1G表明，在所考察范圍內，復合菌最適宜的培養初始pH為7左右，當pH為7時絮凝率達最大值92.84%，而pH過高或過低均會影響微生物的生長和絮凝劑的產生，最適范圍在 pH6～7。

2.1.2.2 正交設計實驗優化營養條件 正交實驗結果表4表明，對高嶺土絮凝率影響的各因素主次順序為A＞D＞B＞C，即影響最大是碳源乙醇，依次分別是pH、氮源NH4NO3和無機鹽KH2PO4。方差分析表5可知，乙醇、NH4NO3、pH對絮凝率的影響均達到極顯著水平，KH2PO4則影響不顯著。不考慮交互作用，復合菌在廢水中的最佳培養條件為A2B1C1D2，即乙醇 1.5mL/100mL、NH4NO30.15g/100mL、KH2PO40.35g/100mL、pH7.0。進一步對正交實驗所得最佳營養條件進行驗證，所得絮凝率達到96.44%，高于正交設計的各組實驗。

表4 L9(34)實驗結果Table 4 Result of L9(34)experiment

2.2 馬鈴薯淀粉廢水中絮凝條件的優化

2.2.1 單因素對COD去除率的影響 由圖2A可知，隨著復合菌投加量增加，COD去除率出現由低—高—低的變化趨勢，當產絮凝劑復合菌投放量為1mL/100mL時，去除率達最大值83.81%。當投放量大于1mL/100mL時，去除率降低，這是由于投藥量加大時，廢水中增加的聚合物將膠體微粒包裹，增加了膠體微粒的穩定性［20］。

廢水pH對絮凝效果的影響如圖2B所示，當pH在4～6之間時，COD去除率較好，均在85%以上，當廢水的pH為5時，COD去除率達到最大值86.97%。此較佳pH范圍也正是馬鈴薯淀粉廢水的pH范圍，因此在實際處理操作中無需添加酸或堿調節廢水的pH，從而降低廢水處理成本。

表5 營養條件優化的方差分析表Table 5 Variance analysis of nutrition conditions optimization

圖2 單因素對COD去除率的影響Fig.2 Effects of single factors on COD removal rate

圖2C和圖2D表明，當添加廢水培養的絮凝復合菌，及 300μL 1mol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、AlCl3溶液后，COD 去除效果較好的是CaCl2、MgCl2，COD 去除率均達到 70% 以上，其中CaCl2助凝效果最佳，去除率達到72.64%，而其他種類的助凝劑都有一定得抑制作用。確定了助凝劑種類后，通過單因素實驗，分別添加1%CaCl2溶液0.5、1、2、3、4、5mL/100mL，結果表明助凝劑 CaCl2隨著投放量增加呈單峰型變化，當2mL/100mL時為COD去除率最佳，達到85.87%，之后去除率不斷下降。

沉降時間對廢水絮凝效果的影響，如圖2E所示，復合菌所產絮凝劑具有良好的沉降性能，在沉降10min時COD去除率即可達到80%以上，當15min時，達到最大值81.85%，沉降20min后COD去除率減小，從處理成本考慮，本實驗選擇10min作為最佳時間。

由圖2F可知，絮凝效果隨著攪拌轉速的增加而增加，當轉速在 100～180r/min時，COD去除率從76.53%上升到88.03%，繼續增加轉速到220r/min時，去除率開始下降，當到達 300r/min時，降至72.31%。可能由于轉速過大或者過小都會影響絮凝活性物質與大分子有機物質的充分接觸和絮凝結合，最終影響COD去除效果。

2.2.2 響應面優化絮凝條件實驗

2.2.2.1 響應面優化結果 實驗設計了三因素三水平共17個實驗點的響應面分析實驗，共由12個析因點實驗，及5個中心點實驗組成，中心點實驗重復5次，用以估計實驗誤差。響應面實驗結果見表6。

2.2.2.2 模型的建立及方差檢驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表6中實驗數據進行二次線性回歸擬合，得到數學模型:

回歸統計分析結果見表7。

由表7可看出，二次回歸模型p＜0.0001極顯著，因變量與所考察自變量之間的關系顯著;復數相關系數R2=0.9848表明所建立的模型可以用來解釋98.48%COD去除率的變化;失擬項p=0.9461＞0.05不顯著，表明模型擬合程度較好，實驗所得二次回歸方程能很好地對馬鈴薯淀粉廢水絮凝處理工藝進行分析和預測。同時可知，除了復合菌投加量和攪拌速度交互作用(AC)不顯著(p＞0.05)外，攪拌速度、復合菌投加量和氯化鈣投加量交互作用(AB)、氯化鈣投加量和攪拌速度(BC)交互作用顯著(p＜0.05)，其余項均對COD去除率有著極顯著的影響，故各因素對COD去除率的影響不是簡單的線性關系，對方程影響的顯著程度依次是復合菌投加量＞氯化鈣投加量＞攪拌速度。

表7 方差分析結果Table 7 Results of variance analysis

表6 響應面分析實驗結果Table 6 Results of response surface design

2.2.2.3 絮凝條件響應面分析與優化 通過Design-Expert軟件分析，得到響應面圖，可直觀反映各因素交互作用對響應值的影響，其中等高線的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著，圓形則與之相反。

由圖3A所示，當攪拌速度一定時，隨著復合菌投加量和CaCl2投加量的增加，COD去除率先增高后快速下降，表明若適當的同時增加復合菌投加量和CaCl2投加量時，可增大COD去除率;當復合菌投加量0.75～1mL/100mL，CaCl2投加量1～2mL/100mL 范圍內，對COD去除率有增效作用，可提升廢水處理效果。由表7和圖3A可知，等高線橢圓，則復合菌和CaCl2投加量對去除率的交互作用顯著。

圖3B可知，當CaCl2投加量在一定條件下，復合菌投加量對COD去除率的影響呈先增大后減小趨勢，攪拌速度對去除率則呈先增大后輕微減小趨勢，當復合菌投加量1mL/100mL，攪拌速度180r/min時，COD去除率會達到最大值。等高線接近圓形，表明兩因素在一定范圍內交互作用不顯著。

圖3C表明，當復合菌投加量不變時，隨著CaCl2投加量和攪拌速度增加，COD去除率先增大后緩慢減小;在 CaCl2投加量 1～2mL/100mL，攪拌速度140～180r/min范圍內，去除率明顯升高，在 CaCl2投加量2～3mL/100mL，攪拌速度 180～220r/min范圍內，COD去除率緩慢減小。等高線為橢圓，兩因素交互作用顯著。

2.2.2.4 廢水處理絮凝條件確定及驗證 對二次回歸方程求一階偏導，得出馬鈴薯淀粉廢水絮凝處理的最佳條件為:復合菌投加量0.98mL/100mL，CaCl2投加量2.08mL/100mL，攪拌速度186.83r/min，此條件下得到理論COD去除率預測值為88.82%。

對模型進行驗證實驗，將復合菌投加量修正為1mL/100mL，CaCl2投加量 2mL/100mL，攪拌速度為187r/min，得出馬鈴薯淀粉廢水的 COD去除率為89.10%，與理論預測值88.82%較為接近，說明模型的擬合程度較好，回歸方程的分析和預測可靠，可利用此工藝條件絮凝處理馬鈴薯淀粉廢水。

2.3 絮凝效果分析

利用最佳工藝處理馬鈴薯淀粉廢水，COD由8537mg/L下降至 931mg/L，COD去除率達到89.10%;濁度值由221mg/L下降至19mg/L，濁度去除率達到91.40%。

圖3 多因素對COD去除率的響應面圖Fig.3 Response surface showing the effects of three factors on COD removal rate

將處理后的廢水過濾沉淀物，經干燥后稱重，得粗蛋白物質6.23g/L，可作為動物蛋白飼料添加劑。

3 結論

通過單因素和正交實驗，馬鈴薯淀粉廢水培養絮凝復合菌的最優營養條件為乙醇1.5mL/100mL、NH4NO30.15g/100mL、KH2PO40.35g/100mL、pH7.0。

在單因素實驗基礎上，通過Box-Bahnken響應面分析實驗，得到絮凝復合菌處理馬鈴薯淀粉廢水工藝的最優條件為復合菌投加量1mL/100mL，CaCl2投加量2mL/100mL，攪拌速度187r/min，COD去除率理論預測值為88.82%，所處理馬鈴薯淀粉廢水的COD去除率實際值為89.10%。

利用最優工藝處理馬鈴薯淀粉廢水，COD降至931mg/L，COD去除率達到 89.10%;濁度值降至19mg/L，濁度去除率達到91.40%，同時得粗蛋白物質6.23g/L，可作為動物蛋白飼料添加劑。

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