響應面法優化獼猴桃皮渣酶解取汁工藝

劉 娟，沈麗雯，蒲 彪，* ，劉春燕，陳安均，劉興艷

(1.四川農業大學食品學院，四川雅安625014;2.開縣農業委員會，重慶開縣405499)

獼猴桃(Actinidia chinensis)又名羊(陽)桃、獼猴梨、奇異果等，隸屬于獼猴桃科(Acyinidiaceae)獼猴屬(Actinidia Lindl)，為漿果落葉木質藤本植物，從北緯50°到赤道附近均有分布，原產于我國長江流域［1］。近代研究表明，獼猴桃不僅具有很高的營養價值，而且還有一定的抗氧化、抗腫瘤、降低脂質過氧化水平、降血壓、治療燒傷等作用［2-5］。

中國作為獼猴桃的起源國，獼猴桃屬植物資源豐富，分布范圍廣，產量居世界前列。我國獼猴桃除了鮮食外，還有各種加工產品主要是獼猴桃果干、果汁、果醬等，隨著獼猴桃果業的不斷發展，其加工副產物也不斷增加。其中就有20%～30%的物質以皮渣的形式被廢棄，不僅降低了獼猴桃加工的附加值，而且形成了新的環境污染源［6］。獼猴桃皮渣中含有大量的膳食纖維、果膠、黃酮類化合物等功能性物質，可廣泛應用于制藥、化妝品、食品工業等，具有很好的利用價值和經濟效益。獼猴桃皮渣用途廣泛，除了從其中提取果膠、可溶性膳食纖維、蛋白質等功效成分以及與整果一起發酵果酒外，目前已開發出多種加工產品，如獼猴桃皮渣飼料、皮渣果醋等［7-9］。

獼猴桃皮渣中果膠物質含量很高，由于其粘性過大因此在壓榨過程中不易直接出汁，因此需要用酶處理或者其它方法提高獼猴桃的出汁率，最常用的方法是使用果膠酶處理從而提高出汁率［10-14］。本研究以獼猴桃皮渣為原料，采用果膠酶酶解方法，通過響應面分析優化皮渣酶解工藝，以期提高獼猴桃皮渣的出汁提高率、減少獼猴桃加工過程中果渣的排放，從而提高獼猴桃的綜合利用率和解決食品加工中環境污染等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 充分成熟，由四川省天全農興源農業發展有限責任公司提供，品種為海沃德［Actinidia deliciosa(A.Chev)C.F.Liang et A.R.Ferguson cv.‘Hayward’］;本實驗以經螺旋壓榨取汁后的皮渣為原料;纖維素酶(30u/g) 上海楷洋生物技術有限公司;果膠酶(5000u/g) 上海藍季科技發展有限公司;氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、鹽酸、乙醇、次甲基亞藍和酚酞等 成都科龍化工試劑廠。

LZ-1.5螺旋榨汁機 張家港白熊韓東機械有限公司;LT 1001型電子天平 常熟市天量儀器有限責任公司;JD 200-3型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;SHB-Ⅲ循環水多用真空泵 菏澤市鑫源儀器有限公司;HH-S6數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市國勝實驗儀器廠水浴鍋;DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器公司;722S型分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料品質分析與預處理 選用新鮮、充分成熟、未變質的獼猴桃為原料，祛病除雜，整果打漿取汁得到皮渣，并且測定包括出汁率和總糖在內的基本品質指標。再將皮渣與水1∶1混合打漿［15］，得到皮渣漿。

1.2.2 酶選擇實驗

1.2.2.1 果膠酶實驗 均勻稱取獼猴桃皮渣漿6份，每份100g，分別裝入6個250mL燒杯中，用檸檬酸調節pH至3.5，分成2組，一組為實驗組，一組為對照組。參照他人對果膠酶酶解皮渣的研究結果，向實驗組加入0.18mg/g果膠酶，對照組不加。置于水浴鍋中，50℃保溫3h后，抽濾，測定皮渣出汁提高率以及汁液的澄清度［16-17］。

1.2.2.2 纖維素酶添加量確定實驗 處理條件為pH4.0，溫度為 55℃，加酶量為 0.08～0.40mg/g，以0.08mg/g為間距，設置不同酶量梯度。

1.2.2.3 混合酶實驗 同果膠酶實驗設置，處理條件為pH4.0、溫度為55℃以及加入0.18mg/g混合酶，果膠酶和纖維素酶的比例分別是 2∶1，1∶1，1∶2。

1.2.3 皮渣酶解單因素實驗

1.2.3.1 酶解溫度的確定 稱取獼猴桃皮渣漿，每份100g，分別放入250mL燒杯中。用檸檬酸調節pH至3.5，加入0.18mg/g在1.2.2中所選取的最佳作用酶，下文中所添加的酶也均為此酶。置于水浴鍋中，分別于30、40、50、60 和 70℃ 中保溫 3h 后，抽濾，測定各組皮渣出汁提高率。

1.2.3.2 酶解pH的確定 酶添加量0.18mg/g、溫度50℃、保溫時間3h。用檸檬酸和碳酸鈉分別調節pH至2.5、3.5、4.5、5.5和6.5，測定各組皮渣出汁提高率。

1.2.3.3 酶用量的確定 溫度50℃，保溫時間3h，pH3.5，分別按 0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20和0.22mg/g加入酶，測定各組皮渣出汁提高率。

1.2.3.4 酶解時間的確定 溫度50℃、pH3.5、酶用量0.18mg/g，分別保溫 1、2、3、4 和 5h，測定各組皮渣出汁提高率［18-19］。

1.2.4 皮渣酶解工藝優化 依據Box-Behnken設計原理和單因素實驗結果，以單因素實驗中對響應值影響顯著的因素為自變量(A:溫度;B:pH;C:時間;D:加酶量)，以出汁提高率為響應值，對皮渣酶解工藝進行響應面分析。響應面實驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素與水平設計表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.5 指標測定方法 pH:酸度計測定;可溶性固形物(TSS，%):手持式糖量計測定法;GB/T 5009.7-2006直接滴定法;總糖:處理參照 GB/T 15038-2006［20］，測定按照 GB/T 5009.7-2006［21］直接滴定法;總酸:GB/T 15038-2006指示劑法。

澄清度:取少量酶解后的澄清汁裝入1cm的比色杯中，650nm下用分光光度計測定其透光率［16］。

皮渣出汁提高率(%)=(實驗組獼猴桃皮渣汁質量-對照組獼猴桃皮渣汁質量)/獼猴桃皮渣質量× 100［17］。

1.2.6 數據分析方法 每次實驗平行測定三次，利用Design Expert8.05b和Origin8.1對所得數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 皮渣品質分析

皮渣品質分析如表2所示。

2.2 酶選擇實驗

2.2.1 纖維素酶用量對皮渣出汁提高率的影響 由圖1可知:隨著纖維素酶添加量的增加，皮渣出汁提高雖增長明顯，但增長的值不大，加酶量高達為0.40mg/g時，出汁提高率僅為(13.2±0.6)%。此外，纖維素酶的價格也高于果膠酶，從經濟的角度考慮，也不宜單獨采用纖維素對皮渣進行酶解。

2.2.2 果膠酶和混合酶對獼猴桃皮渣出汁提高率的影響 從表3可知，在果膠酶添加量為0.18mg/g，pH3.5，50℃水浴3h條件下，皮渣出汁提高率為(32.0±1.2)%，優于其它幾組;汁液澄清度方面，在這幾組實驗條件下，沒有顯著性差異(p＞0.05)。因此，采用果膠酶對獼猴桃皮渣進行酶解工藝優化。

表2 獼猴桃皮渣品質分析Table 2 The quality analysis of Chinese gooseberry pomace

表3 果膠酶和混合酶對獼猴桃皮渣出汁提高率的影響Table 3 Effects of pectinase and combined cellulasen and pectinase on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

圖1 纖維素酶對皮渣出汁提高率的影響Fig.1 Effects of pectinase on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

2.3 皮渣酶解單因素實驗

2.3.1 溫度對皮渣出汁提高率的影響 從圖2可知，當溫度低于50℃時，皮渣的出汁提高率隨著溫度的逐漸升高而不斷增大，在50℃左右達到出汁提高率的最大值。當溫度超過50℃之后，皮渣的出汁提高率隨著溫度的升高而不斷減小，這是由于溫度太高會降低果膠酶的活性，因此，其酶解的溫度以50℃左右為宜。

圖2 溫度對皮渣出汁提高率的影響Fig.2 Effects of temperature on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

2.3.2 pH對皮渣出汁提高率的影響 由圖3可得，當pH在2.5～3.5之間時，皮渣的出汁提高率隨pH的增大而增加;在pH為3.5左右時達到最大，之后隨著pH的逐漸增大，皮渣的出汁提高率緩慢減小;當pH到達4.5之后，出汁提高率快速減小，甚至出現負值，出現這種現象的原因是過高的pH不僅抑制了外源加入果膠酶的活性，而且還影響了皮渣自身含有的果膠酶的活性［19］，由上可得，酶解的pH控制在3.5左右為宜。

圖3 pH對皮渣出汁提高率的影響Fig.3 Effects of pH on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

2.3.3 酶用量對皮渣出汁提高率的影響 由圖4可知，加酶量在0.18mg/g以下時，皮渣的出汁提高率隨加酶量的增加而迅速增加，高于0.18mg/g后，皮渣的出汁提高率增加幅度較小，加酶量為0.18mg/g與0.40mg/g下的皮渣出汁提高率差異性不顯著(p＞0.05)。因此，酶添加量在0.18mg/g左右為宜。

圖4 酶用量對皮渣出汁提高率的影響Fig.4 Effects of total enzyme on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

2.3.4 酶解時間對皮渣出汁提高率的影響 從圖5可得，隨著酶解時間的延長，皮渣出汁提高率不斷增加，但在3h后增長緩慢，皮渣酶解3h與5h的出汁提高率沒有顯著性差異(p＞0.05)，而且隨著時間的延長，能耗也因此加大。所以，從經濟有效的角度考慮，酶解時間應不超過4h。

2.4 響應面優化皮渣的酶解工藝

2.4.1 響應面實驗設計與結果 獼猴桃皮渣酶解響應面實驗結果見表4。

2.4.2 響應面實驗數據回歸分析 采用Design Expert 8.06 b軟件，對響應面實驗數據進行多元回歸擬合。以出汁提高率為響應值(I)，溫度(A)、pH(B)、時間(C)、加酶量(D)為自變量，建立回歸方程如下:

圖5 酶解時間對皮渣出汁提高率的影響Fig.5 Effects of hydrolysis time on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

I=44.10-0.21A-0.27B+2.63C+2.89D+0.20AB-3.43AC-0.55AD-1.35BC-0.20BD+2.43CD-11.95A2-6.89B2-4.17C2-3.30D2

表4 響應面實驗設計及結果Table 4 Test’s data from the response surface design

對二次回歸方程進行方差分析，結果見表5。

從表5可看出，根據p值判斷，p值＜0.0001，說明該模型具有很高的顯著性。方程的失擬項(p＞0.05)不顯著，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。結果表明，C，D，AC，CD，A2，B2，C2，D2對皮渣出汁提高率影響極顯著，其他項為不顯著。說明酶解時間和加酶量對獼猴桃皮渣出汁提高率的影響較強，酶解溫度和酶解pH影響不顯著，其中酶解時間和加酶量對獼猴桃皮渣出汁提高率的影響極其顯著(p＜0.01)，且各因素對獼猴桃皮渣出汁提高率的影響不是簡單的線性關系。對獼猴桃皮渣出汁提高率大小的影響條件依次是酶解時間、加酶量、pH以及溫度。在各因素的交互作用中，酶解溫度與酶解時間以及酶解時間與加酶量的交互作用影響較顯著。

通過響應面的數字最優組合分析得到最佳工藝條件為:酶解溫度48.98℃、pH3.42、酶解時間3.32h、果膠酶用量0.26mg/g，在此條件下，皮渣的預測出汁提高率為45.73%。回歸模型的R2Adj=0.9636，說明有96.36%的獼猴桃皮渣出汁提高率變化可以用模型來解釋，因此擬合度良好，實驗誤差較小，該模型可以用來對獼猴桃皮渣出汁提高率進行分析和預測。

2.4.3 響應面分析 因素之間的交互作用見圖6、圖7。

圖6 酶解溫度和酶解時間對皮渣出汁提高率影響的交互作用響應面圖Fig.6 Response surface diagram for temperature and time on the increased ratio of juice yield from Chinese gooseberry pomace

圖6為酶解溫度與酶解時間之間的交互作用，酶解pH為3.5，加酶量為0.20mg/g，當酶解時間較短時，隨著酶解溫度的升高，獼猴桃皮渣出汁提高率迅速上升后又下降，升高幅度明顯，當酶解時間較短長時，隨著溫度的增加，獼猴桃皮渣出汁提高率上升后又下降，升高幅度較小，獼猴桃皮渣出汁提高率一直處于較高水平;當酶解溫度處于較低水平時，隨著酶解時間的增加，獼猴桃皮渣出汁提高率下降后趨于平穩，當酶解溫度處于較高水平，隨著酶解時間的增加，獼猴桃皮渣出汁提高率升高后降低。酶解解溫度與酶解時間之間的交互作用極顯著。

圖7為酶解時間與加酶量之間的交互作用，酶解溫度為50℃，酶解pH3.5，當酶解時間較短時，隨著加酶量的增加獼猴桃皮渣出汁提高率下降后趨于平穩，之后再上升，升高幅度較小。當酶解時間較長時，猴桃皮渣出汁提高率隨著加酶量的增加而不斷升高，升高幅度較大。當加酶量處于低水平時，當酶解溫度處于較低水平時，隨著酶解時間的增加，獼猴桃皮渣出汁提高率一直處于上升狀態，當加酶量處于較高水平，隨著酶解時間的增加，獼猴桃皮渣出汁提高率下降后上升。水解度酶解時間與加酶量之間的交互作用較顯著。

2.4.4 驗證實驗 經回歸方程計算得到皮渣酶解的最佳工藝參數:酶解溫度48.98℃、pH3.42、酶解時間3.32h、果膠酶用量0.26mg/g，在此條件下皮渣出汁提高率的預測值為45.73%。考慮到實際操作的便利，將酶解工藝條件修正為酶解溫度49℃、pH3.5、酶解時間3.3h、果膠酶用量0.26mg/g，在該條件下，進行驗證實驗，得到皮渣的出汁提高率實驗值為(44.21±1.22)%，與理論值的相對誤差為2.46%。

3 結論與討論

本文以獼猴桃皮渣為原料，研究了果膠酶、纖維素酶以及果膠酶和纖維素酶的混合酶對果渣出汁提高率的影響。結果表明:在同等條件設置下，果膠酶對獼猴桃皮渣出汁的效果明顯優于纖維素酶以及果膠酶和纖維素酶的混合酶，因此，本實驗采用果膠酶對獼猴桃皮渣進行酶解工藝優化。這與劉新等［17］人對柑橘皮渣酶解工藝的研究結果——果膠酶和纖維素酶的混合酶其酶解效果優于單獨使用果膠酶和纖維素酶，有所不同，可能是因為柑橘皮渣中纖維素含量高于獼猴桃皮渣，因此，纖維素酶對其酶解出汁的作用更顯著。

確定了實驗所用酶之后，運用響應面分析方法，對獼猴桃皮渣的酶解取汁工藝進行優化。首先在單因素分析的基礎上，采用Box-Behnken中心組合實驗，建立二次回歸方程模型，模型相關系數R2=0.9636，對模型進行方差分析，確定了獼猴桃皮渣的最佳酶解工藝參數:酶解溫度48.98℃、pH3.42、酶解時間3.32h、果膠酶用量0.26mg/g。這與其他研究者的研究結果在溫度、pH基本相同，但酶解時間和酶用量上有所不同［17-18］，可能是研究的原料和果膠酶種類不同所致。

考慮到實際操作的便利，將酶解工藝條件修正為酶解溫度49℃、pH3.5、酶解時間3.3h、果膠酶用量0.26mg/g，在該條件下，進行驗證實驗，得到皮渣的出汁提高率實驗值為(44.21±1.22)%，與理論值的相對誤差為2.46%。回歸分析與驗證實驗均表明:運用響應面分析方法對獼猴桃皮渣酶解工藝進行優化所獲得的工藝參數科學、可靠。

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