不同提取方法對槐米多糖抗氧化活性的影響

范巧寧，趙 珮，高曉梅，段玉峰

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槐米 產(chǎn)自山東省臨沂市費縣。

1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·) 分析純，美國 Sigma公司產(chǎn)品;三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、三氯化鐵(FeCl3)、六氰合鐵化鉀(［K3Fe(CN)6］)、三氯乙酸(TCA)、苯酚、濃硫酸、乙醇(95%)、抗壞血酸(VC)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、FeCl3、CuSO4.5H2O、NaOH、NaOOC(CHOH)2COOK·4H2O、CCl4、異戊醇 均為國產(chǎn)分析純。

AL 204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海滬西分析儀器有限公司;722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;KQ 3200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司;TU 1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-8B型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽 上海?，攲嶒炘O備有限公司;800B型離心機 上海安亭科學儀器廠;FD-1冷凍干燥機 北京博醫(yī)康技術公司;SHA-e型恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司;T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 槐米多糖提取工藝流程 原料處理:槐米烘干(60℃)→粉碎→過篩(60目)→脫脂(80%乙醇)

提取方法:超聲提取→抽濾→濃縮→醇沉(過夜)→離心(3000r/min，10min)得沉淀→溶解、脫蛋白(sevag法)→透析→冷凍干燥。

熱水浸提:取處理后的干槐米粉5g，置于錐形瓶中，按文獻［8］得到的最佳條件下提取，之后按超聲波提取工藝中的步驟進行處理。

1.2.2 提取分離 參考文獻［9］的方法。液料比30∶1(v/m)，提取時間 42.60min，提取溫度 65.78℃。由于以往文獻沒有介紹超聲功率的影響，本實驗采用單因素實驗法，取5g搓碎槐米，按照上述條件進行超聲波提取醇沉法提取多糖，超聲功率分別為160、240、320、400W，三次平行實驗，苯酚硫酸法［19］測多糖含量，考查超聲功率對槐米多糖得率的影響情況。

1.2.3 多糖含量測定及得率計算 多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法［10］。精確稱取粗多糖10.0mg溶解，定容至100mL容量瓶中，吸取該溶液1.0mL于試管中，依次加入5%苯酚溶液1.0、5.0mL濃硫酸，靜置30min，在490nm條件下測其吸光度值。重復三次，求其平均值。得率計算公式為:

式中，C:溶液中粗多糖濃度;V:溶液總體積;M:脫脂后槐米質(zhì)量。

1.2.4 定性測定

1.2.4.1 紫外光譜分析 蛋白質(zhì)、多肽、核酸等物質(zhì)在260～280nm處有明顯吸收峰，通過紫外掃描鑒別多糖經(jīng)過四次sevag法脫蛋白前后溶液中是否含有蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。

1.2.4.2 酚類物質(zhì)檢測 參考文獻［11］的方法。

沈老七是河口最富有的莊園主，這垸里肥得流油的河沙地大多是他置下的。沈家大院有三進四十八大間，是這方圓百里最氣派的莊園。那時時局很亂，常常有兵隊路過河口，他家就成了不折不扣的兵站。雖然折了些錢財?shù)蚣乙策€算平安無事。不過，那年日本人打過長江駐進沈家大院以后卻引來了血光之災。

1.2.4.3 還原性檢測 將干燥后的槐米粗多糖溶解于適量的蒸餾水中，得粗多糖溶液。取該溶液2mL，加入新配制的斐林試劑2mL，煮沸2min，觀察反應中顏色的變化。

取粗多糖溶液2mL，加入新配制的雙縮脲2mL(先加A試劑2mL，再加B試劑3～4滴)，在沸水浴中反應2min，觀察反應中顏色的變化［11］。

1.2.5 抗氧化活性測定 總還原能力測定:采用普魯士藍法［12］，于1mL不同質(zhì)量濃度的粗多糖(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)的樣品溶液分別依次加入為2.5mL的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和2.5mL的鐵氰化鉀溶液(1%)，混勻，50℃ 水浴20min后，再加入2.5mL、10% 的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液2.5mL，依次加2.5mL蒸餾水和0.1%FeCl3溶液1mL，在700nm處測定吸光度值，吸光度越高，還原能力越強，三次平行，求其平均值，以VC和BHT作為陽性對照。

(DPPH·)清除能力的測定 于0.5mL不同質(zhì)量濃度的粗多糖(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)的樣品溶液依次分別加入0.5mL蒸餾水、2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液(用95%乙醇配制)，充分搖勻，室溫避光反應30min后在517nm處測定吸光度。以95%乙醇代替樣品液作為空白組;以95%乙醇代替DPPH·溶液作為對照組，并以VC和BHT作為陽性對照。按下式計算清除率:

式中，A1:加入樣品后的吸光值;A2:對照組吸光值;A0:空白組吸光值。

羥基自由基(·OH)清除能力的測定 采用芬頓(Fenton)體系鄰二氮菲-Fe2+氧化法進行測定［13］于10mL試管中依次加入2mL FeS04溶液(6mmol/L)、2mL 不同質(zhì)量濃度的粗多糖(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)的樣品溶液、2mL H2O2(6mmol/L)溶液，充分搖勻，靜置10min。再加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL，充分搖勻，靜置30min，在510nm處測定其吸光度值。陰性對照不加樣，以蒸餾水代替。以VC、BHT作陽性對照，每個處理試樣均做三個平行實驗。

計算公式:

式中，A1:加入樣品后的吸光值;A2:樣品本底吸光值;A0:空白吸光值。

式中:A0-鄰苯三酚的自氧化速率;A-加入多糖樣品后鄰苯三酚的自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取分離條件選擇

超聲功率對多糖得率的影響結(jié)果如下:

由圖1知，超聲功率的大小對槐米多糖得率影響不大，超聲功率為320W時，得率最大，得率為1.2%，每個水平進行三次平行實驗(p=0.009＜0.01)，但超聲功率過高會導致多糖降解，因此，選擇320W為較理想。

圖1 超聲功率對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.2 葡萄糖標準曲線的繪制

測定葡萄糖標準曲線如圖2，線性回歸方程為:Y=0.0922X+0.0171，相關系數(shù) R2=0.9998。

圖2 葡萄糖含量標準曲線Fig.2 Standard curve of polysaccharide

2.3 不同提取方法得到的槐米粗多糖的含量

超聲提取:最佳工藝為液料比30.00mL·g-1，提取時間42.60min，提取溫度65.78℃，超聲功率320W，該條件下槐米多糖得率為1.52%;熱水浸提:最佳工藝為提取溫度90℃，料水質(zhì)量比15mL·g-1，提取時間90min，所得槐米粗多糖的得率為1.25%，超聲波提取法比熱水浸提法得率提高了21.6%。由于經(jīng)過了四次脫蛋白，多糖有所損失，因此，測得的槐米多糖得率比以前文獻報道的低一些。

2.4 紫外光譜掃描結(jié)果

圖3所示:在波長260nm無吸收峰，280nm有吸收峰。說明多糖中不含核酸，但含有蛋白質(zhì)(圖3a);四次脫蛋白后，280nm吸收峰消失，說明已將蛋白清除(圖3b)。

圖3 紫外光譜圖Fig.3 The ultraviolet spectrogram

2.5 定性反應結(jié)果

由表1知:槐米多糖經(jīng)過sevag脫蛋白后，定性反應均為陰性，即槐米多糖中無可溶性還原性多糖、游離的蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)。

表1 定性實驗結(jié)果Table 1 The qualitative reaction

2.6 抗氧化活性的測定

2.6.1 總還原能力 抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在直接的聯(lián)系，還原力越強，抗氧化性越強。通常采用鐵氰化鉀氧化樣品來表征還原力，體系中Fe3+在抗氧化劑的促進下變成 Fe2+，形成的Fe2+在700nm處有吸收峰檢出。最終測定的吸光值越大，還原力越強［14］。由圖4可知，超聲提取槐米多糖與水提多糖的還原力與粗多糖質(zhì)量濃度成正相關，與VC還原力相差較大，說明槐米粗多糖的還原力較弱，明顯低于 VC和BHT的還原力。另外，超聲提取所得槐米多糖的還原力略強于水提多糖，當質(zhì)量濃度高于1mg/mL時，超聲提取多糖增加幅度較水提多糖高一些。dps軟件對實驗數(shù)據(jù)分析表明:超聲提取槐米多糖與水提多糖的還原力相比較p=0.0034＜0.01。各個水平進行三次平行實驗，Duncan新復極差法分析:BHT的還原力(p=0.009)達到極顯著水平，VC、超聲提取槐米多糖、水提多糖的還原力(p＜0.05)為顯著。

圖4 槐米多糖的總還原能力Fig.4 Reducing power of Flos Sophora polysaccharides

2.6.2 對DPPH自由基的清除作用 DPPH法是評價抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測定物質(zhì)的抗氧化活性［15］。圖5所示，超聲提取所得槐米多糖清除DPPH自由基的能力優(yōu)于水提槐米多糖，但兩者的清除能力都高于BHT，低于VC。隨著質(zhì)量濃度成倍增加，VC、超聲提取多糖對DPPH·清除作用趨于平緩，相比之下，超聲提取多糖的清除作用變化較大。在質(zhì)量濃度低于0.25mg/mL時，超聲提取多糖與水提多糖對DPPH自由基的清除能力接近，而當質(zhì)量濃度高于0.25mg/mL時，與水提多糖相比，超聲提取多糖上升較快。但在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除能力低于60%。dps軟件對實驗數(shù)據(jù)分析表明:超聲提取槐米多糖與水提多糖清除DPPH自由基的能力相比較p=0.0432＜0.05。各個水平進行三次平行實驗，Duncan新復極差法分析知:BHT、水提多糖、超聲提取槐米多糖、VC對DPPH·清除能力(0.01≤p＜0.05)均在顯著水平范圍。

圖5 槐米粗多糖對DPPH自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect of crude polysaccharides from Flos Sophora on DPPH radicals

圖6 槐米粗多糖對羥基自由基的清除效果Fig.6 Scavenging activity of crude polysaccharides from Flos Sophora on hydroxyl radical

2.6.3 對·OH的清除作用 多糖分子上具有還原性的半縮醛羥基，可將自由基還原，達到阻止自由基連鎖反應的目的，圖6所示，槐米粗多糖的清除·OH的能力與其質(zhì)量濃度正相關。在濃度達到2mg/mL時，VC對·OH的清除可達到98.4%，說明超聲提取粗多糖和水提多糖對·OH的清除作用都與多糖濃度有著較大的依賴關系，隨著粗多糖濃度的增加，·OH清除效果也隨之增加，超聲提取粗多糖比水提多糖的增加幅度大，但當濃度達到2mg/mL時，兩者的清除能力相當，清除率達到75.4%。說明高濃度的槐米粗多糖對·OH也有著明顯的清除作用，能夠有效的抗氧化。dps軟件分析表明:超聲提取槐米多糖與水提多糖清除·OH的能力相比較p=0.0392＜0.05。各個水平進行三次平行實驗，結(jié)果表明:Duncan新復極差法分析p值大小為:BHT(p＜0.001)＜水提多糖(p＜0.01)＜超聲提取槐米多糖(p＜0.01)＜VC(p＜0.01)，即BHT對·OH的清除能力呈極高顯著，其余三個處理均達到了極顯著水平。

在相同質(zhì)量濃度下，超聲提取所得槐米多糖的抗氧化活性優(yōu)于水提槐米多糖，其原因可能有:超聲提取法大大縮短了提取時間，而且提取過程中無化學反應，使得在短時間內(nèi)多糖生物活性沒有損失［18］;兩種多糖的抗氧化活性的差異還可能與不同提取方式所導致多糖分子的單糖組成及糖苷鍵型不同有關［19］。

圖7 槐米粗多糖對·的清除效果Fig.7 Scavenging effect of crude polysaccharides from Flos Sophora on superoxide anion radicals

2.6.5 半數(shù)清除質(zhì)量濃度(EC50)測定結(jié)果 作為評價抗氧化能力的指標EC50，指清除率為50%時所需樣品的質(zhì)量濃度。所需質(zhì)量濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好。由表2知，對自由基清除的EC50值排序為:BHT＞水提多糖＞超聲提取多糖＞VC，這說明在相同質(zhì)量濃度下，超聲提取所得槐米多糖的自由基清除能力要明顯高于水提多糖。因此，超聲提取所得槐米多糖具有較好的抗氧化活性。

表2 多糖和 VC的EC50值Table 2 The value of EC50on polysaccharides and VC

3 結(jié)論

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