松針提取液對慢性便秘小鼠腸道抗氧化能力及通便作用的影響

張晉蔚，錢 江，何玉巧，楊麗華，林楚慧，鄭文瑋，王 響，胡滿江，陳驍熠

(廣州醫科大學公共衛生學院，廣東廣州510182)

慢性便秘是臨床常見的復雜癥狀，長期便秘造成有害物質在腸道堆積，產生過量的自由基、炎癥介質、細胞因子［1］使腸黏膜受損甚至誘發心腦血管疾病、結直腸癌等嚴重的并發癥。流行病學調查表明，受慢性便秘影響的人群已經高達20%［2］，尤其多見于中老年人和體弱多病者［3］。天然產物相對于藥物在治療慢性便秘中具有毒副作用小、安全性高的優點，然而傳統用于通便的大黃和番瀉葉如果長期使用容易引起結腸黑變病和增加患結腸癌的風險［4］。因此，探求一種長期有效且無毒副作用的天然產物具有重要意義。

腸道粘膜是抵御有害物質氧化損傷的第一道屏障［5］，因此增強腸道粘膜的抗氧化能力是治療慢性便秘的重要手段。研究發現槲皮素等黃酮類化合物能夠通過抗氧化作用改善小鼠腸粘膜的氧化損傷［6］。松針食用歷史悠久［7-8］，安全性高［9］，其中的黃酮類化合物、胡蘿卜素、原花青素等天然抗氧化劑能夠清除自由基，增強抗氧化能力［10-11］，保護腸黏膜，維持腸道功能。現代藥理實驗表明松針的抗氧化性對心血管疾病［12］、糖尿病［13］、腫瘤［14］等慢性疾病有積極的防治作用，但對其通便功能鮮有報道。本研究擬通過評價腸道抗氧化能力和通便作用等方面考察松針提取液對慢性便秘小鼠的影響，以期增加松針開發利用的附加值，并為治療慢性便秘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復方地芬諾酯片 長春長紅制藥有限公司;馬尾松松針 采自湖北;大黃 購于大參林藥房;復方地芬諾酯片 江蘇康普藥業;丙二醛(MDA)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒 均購于南京建成生物工程研究所;其它試劑 均為分析純;昆明小鼠，雄性，SPF級，體重(18～22g) 由廣東省動物實驗中心提供。

AK-98超細中藥粉碎機 溫嶺市奧力;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技;X-22R低溫臺式高速離心機 美國Beckman Coulter公司;UV-3900紫外可見分光光度計 日本日立。

1.2 實驗方法

1．2．1 松針提取液的制備 稱取新鮮松針，洗凈，剪成0．5～1cm長，粉碎松針至可通過20目篩后，稱取松針粉 60、3、1．5g于燒瓶中，加入 60mL 蒸餾水，在90℃條件下熱浸提120min，冷卻后減壓抽濾，分別得到 1∶1、1∶20、1∶40(g∶mL)松針提取液。大黃磨粉后，以1∶20(g∶mL)料液比在松針提取液相同條件下浸提制得大黃提取液。

1．2．2 動物分組及處理 將76只健康昆明小鼠隨機分成空白組與便秘組，空白組給予生理鹽水，便秘組給予復方地芬諾酯(5mg/kg BW)造模。兩周后，測定兩組小鼠體重及結腸丙二醛(MDA)含量。再將便秘組按體重隨機分成便秘組、1∶1、1∶20 和 1∶40 松針組、1∶20大黃組，便秘組給予生理鹽水，其余各組給予相應提取液進行干預，共10d。各組小鼠在第7d進行通便作用評價，第10d處死小鼠，取出樣本進行測定。

1．2．3 小鼠通便作用的評價 第6d干預后，各組小鼠禁食不禁水16h，各小鼠給予等量墨汁灌胃，立即放至鋪有濾紙的鼠籠內，每籠小鼠1只，并恢復飼料和飲水，同時開始準確計時。觀察記錄每只小鼠首粒黑便排出用時，并連續觀察5h，記錄5h小鼠黑便的粒數，同時記錄黑便的性狀，并及時稱量排出黑便的濕重。

1．2．4 小鼠結腸丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定 末次干預1h后，眼球取血，靜置2h 后，3500r/min，4℃離心 15min，制備血清，檢測血清中NO的含量。剖開處死后小鼠的腹腔，分離腸系膜，剪取距離回盲部1cm處大腸組織2cm，按照試劑盒提供方法測定其 MDA、NO的含量和SOD、GSH-Px的活性。

1．2．5 統計學分析 實驗數據通過 SPSS20．0軟件進行統計分析，各組計量資料的描述采用均數±標準差(±s)，使用單因素方差分析(ANOVA)及Dunnett-t檢驗進行組間差異比較，p＜0．05表示差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 慢性便秘對小鼠體重及結腸MDA含量的影響

由表1可知，與空白組比較，造模兩周后，便秘組體重明顯減輕(p＜0．05)，說明慢性便秘會造成小鼠體重減輕。而便秘組MDA含量與空白組比較明顯升高(p＜0．01)，表明慢性便秘能夠增加結腸組織氧化程度。

表1 慢性便秘對小鼠體重及結腸MDA含量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s，n=8)

表1 慢性便秘對小鼠體重及結腸MDA含量的影響(±s，n=8)Table 1 The effect of chronic constipation on body weight and colonic MDA content(±s，n=8)

注:與空白組比較，*p ＜0．05，＊＊p ＜0．01。

組別 體重(g) 結腸MDA含量(nmol/mL)34．15 ± 1．55 0．76 ± 0．40便秘組 31．23 ± 1．44* 1．62 ± 0．44空白組＊＊

2.2 松針提取液對慢性便秘小鼠結腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響

如表2所示，與空白組比較，便秘組的MDA含量顯著增加，SOD與GSH-Px活性顯著降低(p＜0．01)。說明在停藥10d后，便秘小鼠腸道的氧化程度仍比正常小鼠高，而抗氧化酶活性降低。與便秘組比，各提取液均能顯著降低結腸組織的MDA含量(p＜0．01)，三組松針提取液均能顯著提高SOD活性(p＜0．05)，而大黃提取液能提高SOD活性，但差異不顯著。研究顯示只有1∶1松針提取液能顯著提高GSH-Px的活性(p＜0．01)，其余各組效果不顯著。結果說明松針提取液能夠提高結腸抗氧化能力，減少結腸的氧化損傷。

表2 松針提取液對慢性便秘小鼠結腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s，n=10)

表2 松針提取液對慢性便秘小鼠結腸MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響(±s，n=10)Table 2 The effect of pine needle extract on antioxidant capacity of chronic constipated mice(±s，n=10)

注:與空白組比較，*p＜0．05，＊＊p ＜ 0．01;與模型組比較，#p ＜0．05，##p ＜0．01，表 3，表 4 同。

組別 MDA含量(nmol/mL)SOD活性(U/mL)GSH-Px活性(U/mL)2．61 ± 1．11 22．22 ± 6．14 41．47 ± 18．40便秘組 5．58 ±2．25＊＊ 14．02 ±2．73＊＊ 35．93 ±14．02＊＊1∶20 大黃 1．94 ± 0．40## 16．73 ± 0．93 30．68 ± 15．19 1∶40 松針 2．55 ± 1．28## 22．46 ± 5．83## 48．40 ± 19．31 1∶20 松針 3．22 ± 1．10## 22．45 ± 7．26# 45．09 ± 15．37 1∶1 松針 2．84 ± 0．91## 24．95 ± 9．77## 55．28 ± 11．93空白組##

2.3 松針提取液對慢性便秘小鼠排便的影響

由表3可知，與空白組比較，便秘組小鼠首粒黑便排出用時明顯延長，5h內黑便粒數和黑便重量明顯減少，結果均具有顯著性差異(p＜0．05)，且經過7d停灌復方地芬諾酯，便秘小鼠的排便功能仍得不到改善，說明慢性便秘小鼠模型穩定。與模型組比較，1∶40松針提取液對黑便重量增加不顯著(p＞0．05)但可以減短首粒黑便排出用時及增加粒數(p＜0．05)，其余各提取液均能明顯縮短便秘小鼠首粒黑便排出用時(p＜0．01)，增加5h內黑便的粒數和重量(p＜0．05)。結果表明，經過松針和大黃提取液干預后，小鼠便秘得到緩解。

表3 松針提取液對慢性便秘小鼠排便的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s，n=10)

表3 松針提取液對慢性便秘小鼠排便的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on laxative activity of chronic constipated mice(±s，n=10)

組別 首粒黑便排出用時(min)黑便粒數(粒)黑便重量(mg)84．22 ± 22．83 13．75 ± 6．43 455．07 ± 28．19便秘組 121．80 ±35．75＊＊ 8．17 ±4．31* 365．04 ±124．75*1∶20 大黃 95．85 ± 16．13# 17．00 ± 4．29## 461．80 ± 63．00#1∶40 松針 85．52 ± 10．61## 13．17 ± 4．12# 435．08 ± 35．15 1∶20 松針 65．14 ±15．57## 14．33 ±3．98# 444．53 ±21．62#1∶1 松針 69．93 ± 28．75## 14．83 ± 4．07# 459．38 ± 46．51空白組#

2.4 松針提取液對慢性便秘小鼠血清及結腸NO含量的影響

表4結果顯示，便秘小鼠血清和結腸中NO的含量均比空白組顯著升高(p＜0．01);各劑量組與便秘組相比，均能顯著降低便秘小鼠中血清與結腸中NO的含量。說明松針與大黃皆能減少NO的產生和作用。

表4 松針提取液對慢性便秘小鼠血清及結腸NO含量的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s，n=10)

表4 松針提取液對慢性便秘小鼠血清及結腸NO含量的影響(±s，n=10)Table 3 The effect of pine needle extract on serum and colonic NO content of chronic constipated mice(±s，n=10)

組別 血清NO含量(μmol/g)結腸NO含量(μmol/g)12．95 ± 5．60 4．70 ± 0．62便秘組 40．09 ±7．13＊＊ 20．19 ±13．51＊＊1∶20 大黃 21．02 ± 5．79## 14．63 ± 6．37#1∶40 松針 23．16 ± 6．79## 13．99 ± 5．32#1∶20 松針 30．87 ± 11．15## 10．63 ± 6．10##1∶1 松針 21．56 ± 11．54## 4．85 ± 4．32空白組##

3 討論

3.1 小鼠慢性便秘致氧化損傷模型的建立

為研究慢性便秘對腸道的氧化作用，本研究參考劉海峰［15］，包云光［16］，智會［17］等使用大鼠造模方法，成功得到穩定的小鼠慢性便秘模型，并首次檢測到結腸的MDA含量升高(p＜0．01)(表1)，結果證明慢性便秘可以造成腸道的氧化損傷。這可能由于小鼠服用復方地芬諾酯后，抑制了腸道蠕動功能，使腸內容物長時間停留在腸道內。腸內容物中的有害物質如吲哚、亞硝胺、酚類等長時間對腸黏膜造成刺激，產生的炎癥介質、自由基等［1］不斷攻擊腸道上皮黏膜、使腸黏膜受到氧化損傷，進而影響腸道的消化及代謝功能，最后導致體重減輕(p＜0．05)(表 1)。

3.2 松針提取液對慢性便秘小鼠氧化損傷的干預作用

本實驗對慢性便秘小鼠進行干預后發現，不同濃度的松針提取液均能明顯增強結腸的抗氧化能力。松針提取液富含蘆丁、槲皮素、葉綠素等多種抗氧化物質，能夠調劑體內的氧化應激反應［18］，加快自由基的清除，減少脂質過氧化產物MDA的產生。同時，松針提取液也可以通過明顯提高SOD的活性(p＜0．05)(表2)，增強便秘小鼠腸道內源性抗氧化能力，使腸道免受自由基的損傷［10］。

本實驗還發現，不同濃度的松針提取液均能夠降低體內NO的水平減少腸道的氧化損傷。NO亦屬于自由基。便秘小鼠腸道內的有害物質會促使腸道菌群產生過量的內毒素，進而激活巨噬細胞和白細胞產生大量的NO［19］。而過量的NO能夠導致細胞因子網絡的失衡，從而產生炎癥反應［20］，損傷腸黏膜，降低腸道功能。在松針提取液干預后，便秘小鼠血清和結腸中的 NO含量明顯減少(p＜0．05)(表4)，小鼠的腸道損傷明顯降低。

3.3 松針提取液對慢性便秘小鼠通便功能的影響

從表3看出松針提取液能夠明顯縮短便秘小鼠排首粒黑便的用時，并能夠增加排黑便的粒數和濕重。表明經過松針提取液干預后，腸道功能得到一定程度恢復，便秘癥狀得到緩解。本實驗中，由于三組松針是在不同料液比的條件下進行提取，各提取液中活性物質的含量和組成各不相同，因此對小鼠體內的抗氧化活性和排便的效果也有所不同。

4 結論

本研究通過使用松針提取液對慢性便秘小鼠進行干預，發現松針提取液能夠緩解慢性便秘致小鼠結腸的氧化損傷，提高腸道的抗氧化能力，進而改善小鼠的通便功能。本研究為開發松針通便功能性食品提供了理論依據。

［1］王輝，陳海龍，范琦，等．大鼠腸巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子的規律及復方大承氣湯影響的研究［J］．中國中西醫結合外科雜志，2003，9(1):6-8．

［2］ DiPalma J A．Currenttreatmentoptions forchronic constipation．［J］．Reviews in gastroenterological disorders，2004，4 Suppl 2:S34-S42．

［3］Peppas G，Alexiou VG，Mourtzoukou E，et al．Epidemiology of Constipation in Europe and Oceania［J］:A Systematic Review．BMC Gastroenterol，2008，8:5．

［4］Nascimbeni R，Donato F，Ghirardi M，et al．Constipation，anthranoid laxatives，melanosis coli，and colon cancer:a risk assessment using aberrant crypt foci［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev ，2002，11:753-757．

［5］謝尚奎，任東林，彭慧，等．結腸慢傳輸型便秘患者腸黏膜屏障功能的狀態［J］．中華消化雜志，2003，33(12):849-852．

［6］孟德勝，汪仕良．槲皮素等對燙傷后小鼠腸粘膜損傷的保護作用［J］．中國藥理學通報，2000(06):673-675．

［7］胡鈞，呂圭源，李萬里，等．馬尾松松針提取物保健及藥用價值研究［J］．林產化工通訊，1992(6):10-11．

［8］黃順東．松針臨床應用及藥理研究概況［J］．實用中醫藥雜志，2005(8):514-515．

［9］陳驍熠，陳玉書．松針保健飲料的研制［J］．食品研究與開發，2002(6):67-69．

［10］曾明，李守漢，郭層城，等．松針提取液抗氧化作用研究［J］．衛生職業教育，2009(24):105-107．

［11］張培剛，鄭鴻雁，昌友權，等．松針黃酮的體外抗氧化作用研究［J］．食品科學，2005(9):488-490．

［12］熊春梅，郭愛偉．松針提取物藥理作用研究進展［J］．動物醫學進展，2010(12):104-107．

［13］王春梅，王海莉，李賀，等．松針提取物降糖作用的實驗研究［J］．北華大學學報:自然科學版，2007(2):121-123．

［14］周微，鄭曉珂，王小蘭，等．松針不同提取部位體外抗腫瘤作用的實驗研究［C］．2008年中國藥學會學術年會暨第八屆中國藥師周．中國河北石家莊:12．

［15］劉海峰，何俊堂，汪興偉，等．大鼠慢傳輸型便秘模型的建立及其結腸肌電變化檢測［J］．武警醫學，2004，15(12):887-891．

［16］包云光，舒小莉，李小兵，等．腸神經系統遞質和Cajal間質細胞在大鼠慢傳輸型便秘中的作用［J］．中國當代兒科雜志，2009，11(6):481-485

［17］智會，袁維堂．水通道蛋白3、4、8在大鼠慢傳輸型便秘模型結腸黏膜中的表達［J］．中華胃腸外科雜志，2011，14(6):459-461．

［18］周偉，曾明，郭層城．松針提取液對DNA氧化損傷的保護作用研究［J］．山東體育科技，2009(1):39-40．

［19］李云峰，郭長江，韋京豫，等．槲皮素對小鼠腹腔巨噬細胞氧化應激反應與功能的影響［J］．解放軍預防醫學雜志，2007，25(3):160-163．

［20］Kim YW，Zhao RJ，Park SJ，et al．Anti-inflammatory effects of liquiritigenin as a consequence of the inhibition of NF-kappa B-dependent iNOS and proinflammatory cytokines production［J］．Brit J Pharmcol，2008，154:165-173．