酒類酒球菌31MBR β-D-葡萄糖苷酶超聲提取工藝優化

董 梅，李亞輝，樊明濤，李愛霞，王盼雪

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100)

葡萄酒的釀造過程主要包括兩個階段:酵母主導的酒精發酵和乳酸菌主導的蘋果酸-乳酸發酵，蘋果酸-乳酸發酵對葡萄酒香氣物質的形成具有重要作用［1-2］。

目前，酒類酒球菌是啟動葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵最重要、應用最廣泛的乳酸菌。酒類酒球菌能夠適應葡萄酒中苛刻環境，較專一地進行蘋果酸-乳酸發酵，大大改善葡萄酒的品質［3-4］，近年來對此類菌的研究有大量報道［5-6］。葡萄酒的香氣除了來自葡萄本身的果香外，很大一部分來自酒中結合態香氣物質糖苷降解產生的游離態香氣物質［7-8］。酶解具有高效、專一、條件溫和等特點，在實際生產中一般采用此方法來降解葡萄酒中結合態呈香物質，產生揮發性香氣物質，增加葡萄酒香氣、改善葡萄酒風味。

β-D-葡萄糖苷酶是降解結合態香氣物質的關鍵酶，它能催化水解芳基或烴基與糖基之間的糖苷鍵生成葡萄糖及揮發性物質［9］。酒類酒球菌31MBR是國內常用的一株釀酒乳酸菌，具有良好的蘋果酸乳酸發酵性能，已有研究表明，此菌產生的 β-D-葡萄糖苷酶酶活較高，且為胞內可溶性酶［10］。對胞內酶檢測需要進行細胞破碎處理，目前報道的物理研磨法、化學溶解法等，效果不是十分理想，酶活不能精確測定［11］。超聲波破碎法對其他生物性材料酶提取的效果較好，本文系統地研究超聲波對酒類酒球菌細胞的破碎效果和對β-D-葡萄糖苷酶酶活的影響，對乳酸菌屬微生物葡萄糖苷酶的提取分離純化具有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒類酒球菌31MBR為實驗室保存菌株。

對-硝苯-β-葡萄糖苷(p-NPG) 美國Sigma公司;所用其他試劑均為分析純，西隴化學試劑。

ATB培養基:蛋白胨 10g/L，酵母浸粉 5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，葡萄糖 10g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5g/L，實驗室自制番茄汁250mL/L，pH 調至 4.8，121℃滅菌20min。

HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;HS-840μ型水平層流單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;UV-3802H紫外可見分光光度儀 上海尤尼柯儀器有限公司;VC-130超聲波細胞破碎儀 美國Sonics＆Materials公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體制備 酒類酒球菌31MBR于ATB固體培養基中25℃靜置培養，在ATB液體培養基中轉接2次，分別培養40h至對數生長末期。取1mL菌液，離心收集菌體(4℃，5000×g，10min)。用 150mmol/L NaCl洗滌菌體，離心(4℃，5000 ×g，10min)棄上清液。重復洗滌三次，收集菌體備用。

1.2.2 葡萄糖苷酶提取方法

1.2.2.1 超聲波破碎法 用1mL PBS緩沖液(NaCl 140mmol/L;KCl2.7mmol/L;Na2HPO410mmol/L;KH2PO41.8mmol/L;pH7.4)重新懸浮菌體，混勻，將菌體置于冰上，進行超聲波破碎，破碎后離心(4℃，12000×g，10min)，上清液即為粗酶液。

1.2.2.2 反復凍融法破碎細胞 菌體經洗滌后加入1mL PBS緩沖液，在-20℃冰箱中凍存20min，取出置于20℃水浴中溶解10min，如此重復5次。離心后所得的上清即為粗酶液［11］。

1.2.2.3 玻璃珠法破碎細胞 菌體經洗滌后加入1mL PBS破碎緩沖液，放入適量酸洗玻璃珠，冰浴。高速漩渦振蕩30s，停30s，如此重復30min。離心后所得的上清即為粗酶液［11］。

1.2.3 葡萄糖苷酶活性測定 葡萄糖苷酶活性測定參照Barbagallo等所采用的方法［12］，并略作修改。準確吸取0.5mL粗酶液，加入 0.5mL底物緩沖液(pH5.0)，于30℃恒溫水浴1h，反應結束后立即加入2mL 1mol/L Na2CO3終止反應，于400nm處測定吸光度。酶活定義:30℃時，每分鐘每克干菌重生成對硝基苯酚的量(μmol)為1個酶活單位，即酶活單位為μmol/(min·g)。

1.2.4 蛋白含量測定 采用紫外吸收法測定蛋白含量。配制不同濃度的牛血清蛋白，并分別測定其在280nm處的吸光值。以牛血清蛋白濃度x為橫坐標，吸光值A為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為A=0.7092x-0.0086，R2=0.9996，為高度顯著。測定粗酶液在280nm處的吸光值，對照標準曲線即可得到粗酶液蛋白濃度。

1.2.5 超聲波破碎條件確定 實驗分為單因素實驗和響應面優化兩部分，單因素實驗時，分別考察破碎時間(5、10、15、20、25、30、35min)、破碎功率(90、100、110、120、130W)、菌體濃度 (OD 值分別為1.202、1.387、1.608、1.792、2.044)對葡糖糖苷酶的影響。以單因素實驗為基礎，按照Box-Behnken原理設計實驗，利用Design-Expert軟件對實驗數據進行回歸擬合，采用響應面優化最終確定超聲波破碎提取酶的最佳工藝條件。實驗設計中的水平及編碼表見表1。

表1 響應面分析實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結果與分析

2.1 超聲波破碎條件單因素研究

2.1.1 破碎時間對提取葡萄糖苷酶的影響 超聲波破碎時間對酶提取效果的影響如圖1所示。當破碎功率為130W，菌體密度OD600為2.0時，可以看出隨著時間的延長，總蛋白和總酶活力都呈上升趨勢，但是比活力在10min以后增加得不明顯，甚至有降低的趨勢。酶的純度可由比活力表示，破碎時間延長，細胞內總蛋白釋放量增加，目的蛋白也有所增加，但是比活力并沒有因此提高。破碎時間延長，導致破碎體系內熱量增多，可能是由于目的蛋白對熱敏感，使其催化活性部位受到損害，使酶的比活力下降［13］。所以選擇的破碎時間范圍為10、15、20min。

圖1 超聲波破碎時間對酶提取的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction of glucosidase

2.1.2 破碎功率對提取葡萄糖苷酶的影響 破碎功率對酶提取效果的影響如圖2所示。當破碎時間為15min，菌體密度OD600為2.0時，可以看出隨著功率的增加，總蛋白和總酶活都有增加，說明破碎功率增大有助于細胞的破碎，但是比活力在120W的輸出功率時達到最大，在最大功率130W有降低的趨勢，原因可能是破碎功率上升導致熱量增大，破壞了酶活。所以破碎功率為110～130W。

圖2 超聲波功率對酶提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction of glucosidase

2.1.3 菌體密度對提取葡萄糖苷酶的影響 將不同濃度的菌體在超聲波功率為130W的條件下處理15min，結果如圖3所示。從圖中可以看出，雖然酶的總活力一直在升高，但是酶的比活力在OD600值大于1.6后基本不變。菌體濃度會影響超聲波的空化作用，當菌濃度高的時候，超聲波破碎難以形成空化效應，而能量大多被轉化為熱量，不但不能破碎，反而破壞了樣品中的酶活性。所以選擇的菌體濃度OD600為 1.6、1.8、2.0。

圖3 菌體密度對酶提取的影響Fig.3 Effect of cell concentration on extraction of glucosidase

2.2 葡萄糖苷酶提取條件的優化

以破碎時間、破碎功率、菌體濃度為響應變量，根據單因素實驗確定上下水平后，按Box-Behnken原理設計實驗，進行優化分析。實驗設計及結果見表2。利用Design-Expert軟件對表2實驗數據進行回歸擬合，得到葡萄糖苷酶活力對破碎時間、破碎功率和菌體濃度三個因素的二次多項回歸模型為:

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Test design and results of Box-Behnken

對該模型的數學回歸分析結果見表3。其中回歸模型的p值＜0.0001，表明回歸模型極顯著;一次項均極顯著，二次項均極顯著;交互項AB、BC不顯著，AC顯著，這表明各種影響因素對葡萄糖苷酶的活性的影響不是簡單的線性關系。失擬項p值為0.1901，大于0.05，不顯著，相關系數 R2=0.9964，說明模型擬合程度良好，可用此模型來分析和預測葡萄糖苷酶的最佳提取條件。通過對三個因素F值的比較，可以得出三個因素對酶活力的影響:C＞A＞B，即菌體濃度＞破碎總時間＞破碎功率。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

2.3 實驗因素對酶活力的影響

破碎時間和破碎功率的交互作用對酶提取效果影響如圖4所示，由圖中可以看出這兩個因素交互作用對酶活的影響不顯著(p=0.3149)，酶活力隨著時間的延長呈現增大的趨勢，也隨破碎功率的增大呈現增大趨勢，而且破碎時間的響應面曲線更陡一些，說明時間對酶活的影響更顯著。

圖4 Y=(A，B)響應面立體圖Fig.4 Y=(A，B)response surface stereogram

破碎功率和菌體濃度交互作用對酶提取效果的影響如圖5所示。可以看出，這兩個因素交互作用對酶活的影響不顯著(p=0.2965)，酶活力隨著這兩個因素的各自增大都呈現增大趨勢，與破碎功率相比，菌體密度的響應曲面更陡，說明對酶提取的影響更顯著。

圖5 Y=(B，C)響應面立體圖Fig.5 Y=(B，C)response surface stereogram

破碎時間和菌體濃度交互作用對酶提取效果的影響如圖6所示。這兩個因素交互作用對酶活的影響顯著(p=0.0392)，酶活力受到這兩個因素共同作用的影響。且菌體密度的響應曲線更陡，說明菌濃度對酶提取的影響更顯著。

圖6 Y=(A，C)響應面立體圖Fig.6 Y=(A，C)response surface stereogram

根據回歸方程繪出響應面分析圖，用軟件分析后，得到最適的葡萄糖苷酶提取條件為:A=0.94，B=1，C=1，經轉換后，得出三因素的值分別為:破碎總時間19.7min，破碎功率130W，菌體濃度為OD600=2.0。在此條件下，預測值最大酶活為14.45U。考慮到實際可操作性，選擇破碎總時間為20min，破碎功率為130W，菌體濃度OD600=2.0，實際測得的酶活為13.89U，與預測值相近。

2.4 超聲波破碎法與其他破碎方法的比較

利用優化的超聲波破碎條件進行糖苷酶提取，并比較了該方法與反復凍融法和玻璃珠法對酶提取效果的不同，結果如圖7所示。可以看出用優化的方法得到的酶活顯著高于其他兩種方法。

圖7 三種破碎方法對酶活的影響Fig.7 Enzyme activity of β-Glucosidase by three methods

本實驗結果表明，與其他破碎方法相比，超聲波可以很好地破碎酒類酒球菌31MBR細胞壁，從而釋放β-D-葡萄糖苷酶。超聲波有強烈的生物學效應，進行超聲波處理時，超聲波的高頻振動與微生物的振動不協調，造成細胞周圍環境局部真空，使細胞膜產生空化作用，從而使之破碎［14-15］。

破碎時間和破碎功率主要會影響體系中的熱量，時間越長，功率越大產生的熱量越多，可能會因此導致酶失活。菌體濃度主要會影響到超聲波破碎的空化效應，菌體太多，難以形成足夠的水泡使細胞破裂，所以也會影響蛋白的釋放量，不能空化則會產生大量的熱，導致酶失活［15-16］。本實驗系統地研究了超聲波對酒類酒球菌的破碎效率，并比較了三種方法對酶活的影響，為后續實驗提供了理論和技術支持。

3 結論

本研究所得超聲波破碎法提取酒類酒球菌31MBR胞內β-D-葡萄糖苷酶的最佳條件為:破碎總時間20min，破碎功率130W，菌體濃度為OD600=2.0。按此方法得到粗酶液的總酶活為13.89U，與預測值相近。用優化的方法得到的酶活顯著高于用反復凍融法和玻璃珠法得到的酶活。

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