苦瓜皂苷對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

尤玲玲，陳永慧，劉金福，靳曉明，馮 超

(1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384;

2.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津300384)

糖尿病是一種全球范圍內嚴重危害人類健康的常見內分泌代謝疾病，有95%的糖尿病患者為Ⅱ型糖尿病［1］。Ⅱ型糖尿病是一種復雜的多基因疾病，胰島β細胞功能缺陷和胰島素抵抗是其發病的兩個主要原因［2］。體內胰島素對肝臟、脂肪和肌肉三大主要靶組織都有影響［3］。胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病、肥胖癥、高血壓、血脂異常和心血管疾病的多元綜合癥［4］。胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指正常劑量的胰島素產生低于其生物學效應的一種病理學狀態，表現為胰島素促進外周組織攝取和利用葡萄糖以及抑制肝糖輸出的效應減弱［5］。肝臟及外周組織是胰島素作用的靶組織，是胰島素抵抗產生的主要部位。

建立胰島素抵抗的細胞模型，不僅可廣泛用于細胞水平探討胰島素抵抗形成的機制和葡萄糖代謝障礙的病理、生理學環節，而且便于篩選具有改善胰島素抵抗活性的成分。HepG2細胞來源于肝細胞，系一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株［6］，在高劑量的胰島素條件下，HepG2細胞表面胰島素受體的數目下降，下降程度與胰島素水平及刺激持續的時間呈正相關［7］，因此HepG2是體外研究胰島素抵抗發病機制和降糖活性物質篩選的理想細胞模型。

苦瓜別名涼瓜、錦荔枝、癩瓜，具有清熱解毒、滋養強壯、明目和解勞乏之功效［8］。近年來，對苦瓜成分的研究報道很多且較深入，從苦瓜的果實、根、莖、葉、花及種子等部位中分離出苦瓜皂苷、多糖、蛋白質和多肽等多種化學成分，并證明其具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、提高免疫力等多種功效［9］。本文以人肝癌HepG2細胞為研究載體，建立最佳胰島素抵抗模型，探究苦瓜皂苷對胰島素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2細胞株 北京腫瘤醫院細胞庫;牛胰島素、DMSO Sbasebio公司;DMEM高糖培養基Hyclone公司;胎牛血清 天津灝洋生物技術有限公司;青-鏈霉素美國Gibco公司;胰蛋白酶(1∶250) 天津博美科生物技術有限公司;葡萄糖測定試劑盒 北京普利萊基因技術有限公司;苦瓜皂苷 我校食品營養與免疫學實驗室提供，純度:58%;其余化學試劑均為國產分析純。

TD5A-WS型臺式低速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;IX51倒置相差熒光顯微鏡 日本Olympus公司;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;3111型CO2細胞培養箱 美國Thermo Forma公司;Bio-Tek ELX800型全自動酶標儀 美國寶特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HepG2細胞的常規培養 HepG2細胞用含15%胎牛血清，1‰青-鏈霉素的DMEM培養液，于37℃，5%CO2飽和濕度環境下培養。

1.2.2 胰島素抵抗HepG2細胞模型(HepG2/IR)的建立

1.2.2.1 胰島素添加濃度的確定 將HepG2細胞制成單細胞懸液，以105個/mL細胞密度接種于96孔板，每孔 100μL，于 37℃，5%CO2條件下培養細胞12h，加入新鮮配制的胰島素(終濃度為 0.5、5、10、15、30、60、150、300μg/mL)繼續培養細胞24h，每組 6個復孔，同時設立正常培養的細胞作為對照，用葡萄糖氧化酶法測定細胞培養液中葡萄糖的含量，計算對照組與不同胰島素濃度組細胞的葡萄糖消耗量，選擇葡萄糖消耗量最大，即胰島素敏感性最強時胰島素的濃度為最佳添加濃度。

1.2.2.2 確定胰島素作用細胞的最佳時間 確定了最佳胰島素濃度后，設對照組和作用時間組(12、24、36、48h)，依1.2.2.1方法向孔板中加入最佳濃度胰島素溶液，分別作用細胞 12、24、36、48h，計算正常組與各作用時間組的細胞葡萄糖消耗量差值，選擇葡萄糖消耗量差值最大的作用時間為胰島素作用最佳時間。

依照上述方法分別得出胰島素作用最佳濃度和作用時間，由此建立適宜的高濃度胰島素誘導的HepG2/IR細胞模型。

1.2.3 苦瓜皂苷干預HepG2/IR細胞

1.2.3.1 苦瓜皂苷對HepG2/IR葡萄糖消耗量的影響 以細胞密度為2×105個/mL接種于96孔板，每孔100μL，培養12h，分別設立HepG2細胞陰性對照組，HepG2/IR模型組、鹽酸吡格列酮陽性對照組(4μg/mL)、苦瓜皂苷干預組(終濃度為 10、100、200、300、500、1000、2000μg/mL)。陰性對照組和 HepG2/IR模型組中加入50μL DMEM培養液，HepG2/IR模型組、陽性對照組以及苦瓜皂苷干預組每孔加入50μL胰島素溶液至終濃度30μg/mL，孵育36h后，陽性對照組中加入50μL鹽酸吡格列酮溶液(終濃度為4μg/mL)，苦瓜皂苷干預組分別加入50μL終濃度為 10、100、200、300、500、1000、2000μg/mL 的苦瓜皂苷溶液，孵育12h，3600r/min離心10min，按葡萄糖試劑盒測定方法測定細胞培養液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

葡萄糖含量(mmol/L)=標準品濃度×［(OD樣品管-OD空白管)/(OD標準管-OD空白管)］

1.2.3.2 MTT測定HepG2/IR細胞活性 棄去96孔板中苦瓜皂苷干預后的培養液，每孔加入MTT(終濃度5mg/mL)溶液20μL，繼續培養4h后，棄去培養板中溶液，每孔加入100μL DMSO終止反應，充分振搖，利用酶標儀檢測波長490nm下吸光度值［10］。

1.3 數據統計分析

實驗數據用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，數據以±s表示，采用單因素差異性分析以及多重比較組間差異。

2 結果與分析

2.1 胰島素濃度和作用時間對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

2.1.1 不同濃度的胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 分別設立對照組和胰島素劑量組(0.5、5、15、30、60、150、300μg/mL)作用 HepG2 細胞 12h 后測得細胞葡萄糖消耗情況見表1。當胰島素濃度由15μg/mL增加到300μg/mL時，與正常組相比，葡萄糖含量均有顯著降低，結合考慮葡萄糖消耗率，發現當胰島素濃度達30μg/mL時，葡萄糖消耗率最高達18.28%。說明30μg/mL的胰島素誘導HepG2細胞胰島素抵抗程度達到最大。

表1 不同濃度的胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗情況的影響Table 1 Effect of different concentration insulin to the glucose consumption of HepG2

2.1.2 胰島素作用不同時間對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響 設立不同作用時間組(12、24、36、48h)的同時，設立相應的各時間點的陰性對照組，孵育好的細胞加入胰島素至終濃度30μg/mL，分別作用12、24、36、48h，測得細胞葡萄糖消耗情況見表2。隨著胰島素作用時間的延長，不同作用時間組細胞葡萄糖的消耗均低于正常組，分別降低14.07%，17.76%，20.28%，18.07%。當胰島素作用細胞36h時與其相應的陰性組比較，葡萄糖消耗差異最大達20.28%，差異極顯著(Ap＜0.01);48h時葡萄糖消耗量差值也較大，且差異極顯著(Ap＜0.01)，但考慮到胰島素作用HepG2細胞的時間過長，中間又沒有換液，其細胞活力可能會有所下降。因此，本實驗胰島素誘導細胞HepG2建立胰島素抵抗模型的最佳作用時間為36h，最佳胰島素濃度為30μg/mL，同時也印證了HepG2細胞株是國內外應用較廣泛的研究胰島素抵抗機制的細胞模型［11］。

表2 胰島素不同作用時間對HepG2細胞葡萄糖消耗情況的影響Table 2 Effect of different insulin effect time to the glucose consumption of HepG2 cells

2.2 苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗量及細胞活性的影響

2.2.1 不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗量的影響 成功建立HepG2/IR細胞模型后，設立不同濃度的苦瓜皂苷作用HepG2/IR細胞，測定葡萄糖消耗情況見表3。與HepG2/IR模型對照組相比較，隨著苦瓜皂苷濃度的增大，葡萄糖含量均有所回升，說明苦瓜皂苷可以在一定程度上緩解胰島素抵抗，其中300、500μg/mL劑量的苦瓜皂苷作用顯著(bp＜0.05，)。與鹽酸吡格列酮陽性對照組相比較，300、500μg/mL劑量的苦瓜皂苷作用顯著(cp＜0.05)。同時結合考慮葡萄糖消耗率，300μg/mL劑量的苦瓜皂苷作用效果最理想。

表3 不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞葡萄糖消耗情況的影響Table 3 Effect of different concentration bitter melon saponin to The glucose consumption of HepG2/IR

當苦瓜皂苷濃度高于300μg/mL時，葡萄糖消耗量整體呈現下降趨勢，盡管葡萄糖消耗量隨著濃度的增加而減少，但與HepG2/IR模型組相比較，葡萄糖消耗量仍有所提高，說明苦瓜皂苷還是在不同程度上促進了HepG2/IR細胞消耗葡萄糖。

2.2.2 苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞活性的影響 如圖1所示，與陰性對照組相比，HepG2/IR模型組，鹽酸吡格列酮陽性對照組以及苦瓜皂苷組的細胞活性均低于陰性對照組，這是因為高濃度的胰島素降低了HepG2細胞的活性;苦瓜皂苷組與陰性對照組相比較，苦瓜皂苷濃度由10μg/mL增加至300μg/mL時，隨著皂苷濃度的增加，細胞的活性逐漸提高，達到300μg/mL時，細胞活性顯著提高，吸光度值達0.226，差異具有統計學意義(p＜0.05);高于300μg/mL時，HepG2/IR細胞的活性反而降低了，可能是過高劑量的苦瓜皂苷存在毒性效應，這一點與葡萄糖消耗量實驗結果一致。

圖1 不同濃度的苦瓜皂苷對HepG2/IR細胞活性的影響Fig 1. The effect of different concentration bitter melon saponin to activity of HepG2/IR

3 結論

本文以HepG2細胞為研究對象，采用一系列不同濃度的胰島素作用HepG2細胞，發現30μg/mL胰島素作用細胞36h時產生的胰島素抵抗效果最強。苦瓜皂苷濃度在低于300μg/mL時，隨著濃度的增大，可改善由高濃度胰島素帶來的細胞活性降低。當苦瓜皂苷濃度高于300μg/mL時，隨著濃度的增大對HepG2細胞產生的劑量毒性效應增加，抑制了細胞的生長?？梢姡谝欢ǖ臐舛确秶鷥?，300μg/mL苦瓜皂苷可以顯著改善HepG2/IR細胞的活性，同時提升葡萄糖消耗量，起到較好的降糖效果。

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