大鼠腦出血后血腫周圍組織中p75NTR、TrkA的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

陜西省新安中心醫(yī)院內(nèi)科（西安710048） 鮑 昕 王 寧 李傳坤 徐高峰 鮑 剛

腦出血（Cerebral hemorrhage，CH）是一種臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有很高的致死率和致殘率。我國每年約有140余萬人發(fā)生急性腦出血，其病死率約為40%～60%，存活者中留有病殘的約70%～80%，其中40%遺留嚴(yán)重殘疾［1］，嚴(yán)重威脅到患者的生命及生存質(zhì)量。研究證實(shí)：腦出血后一段時(shí)間內(nèi)存在的細(xì)胞凋亡為腦出血后繼發(fā)性損傷的一種，延續(xù)和加重了腦出血病情的發(fā)展，對患者的預(yù)后帶來了不利的影響［2］。

本研究采用立體定向腦內(nèi)注射法制備腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，檢測腦出血后血腫周圍組織中的凋亡細(xì)胞比例以及p75NTR、TrkA的蛋白及RNA表達(dá)水平，用以探討p75NTR、TrkA的表達(dá)與腦出血后細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以期闡明p75NTR、TrkA在腦出血后細(xì)胞的凋亡中所發(fā)揮的作用。

材料與方法

1 動物與分組 SD雄性大鼠50只，體重230～250g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將其隨機(jī)分為5組，每組10只，其中4組為實(shí)驗(yàn)組（即ICH組），1組為對照組（即假手術(shù)組）。實(shí)驗(yàn)組按腦出血后處死時(shí)間分為6h組、24h組、72h組及10d組，對照組在假手術(shù)后10d處死。

2 器材與試劑 ①主要實(shí)驗(yàn)器材：動物立體定向儀，流式細(xì)胞儀，顯微照相系統(tǒng)，BIO－RAD熒光定量PCR儀。②主要實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗鼠p75NTR抗體、兔抗鼠TrkA抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司；DAB酶底物顯色試劑盒、即用型SP系列檢測試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司。RNA提取試劑盒Fast200購自飛捷生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；熒光定量PCR試劑盒購自美國Bioer公司；p75NTR、TrkA引物及內(nèi)參β－actin由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，p75NTR的序列：上游 引 物 P1：5’－CCTCATTCCTGTCTATTGCTCCATC－3’，下 游 引 物 P2：5’－TTCCTCACCTCCTCACGCTTGG－3’，TrkA 的序列：上游引物 P1：5’－AGGTGGCTGCTGGTATGGTG－3’，下 游 引 物 P2：5’－GTGCTGAACTTGCGGTAGAGG－3’，β－actin的序列：上游引物 P1：5’－CTATCGGCAATGAGCGGTTCC－3’，下 游 引 物 P2：5’－TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG－3’。

3 腦出血?jiǎng)游锬Ｐ徒⒓皹?biāo)本制作 使用立體定向儀，于大鼠尾狀核頭的體表投影處用鉆孔，采用大鼠尾部自體血約80μl，用微量注射器緩慢勻速地推進(jìn)右側(cè)尾狀核頭（對照組只插入針頭不注血）。分別于建模后6h，24h，72h，10d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)組大鼠，對照組于假手術(shù)后10d處死。以穿刺針道為中心，取血腫周圍（對照組取穿刺到周圍）5mm以內(nèi)的腦組織備用。

4 流式細(xì)胞儀檢測凋亡百分比 將組織塊剪碎后緩慢吹打至勻漿狀，過濾，收集濾液，4℃、1000rpm，離心5mins，棄上清，重懸于磷酸鹽緩沖溶液（4℃），再次離心（4℃、1000rpm）5mins，重懸；取1～5×105細(xì)胞懸液，1000rpm，離心5mins后棄上清重懸于500μl的結(jié)合緩沖液（4℃）中，依次加入5μl異硫氰酸熒光素及10μl碘化丙稀，輕搖混勻，室溫下避光反應(yīng)15min后直接上機(jī)檢測。

5 免疫組化 采用S－P法，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，所有標(biāo)本均在同一條件下采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，各步驟間均用磷酸鹽緩沖液沖洗，并用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。

6 Real－time PCR檢測p75NTR、TrkA 基因表達(dá) 在無菌條件下，從液氮罐中取出腦組織，按照各實(shí)驗(yàn)分組相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)行RT－PCR分析，按RNA提取試劑盒Fast 200說明提取組織總RNA，采用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按操作說明逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究對所得數(shù)據(jù)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 血腫周圍組織中的細(xì)胞凋亡情況 見表1。ICH6h后細(xì)胞凋亡率顯著上升，72h達(dá)到高峰，10d組細(xì)胞凋亡率有所下降，各實(shí)驗(yàn)組分別與對照組進(jìn)行比較均存在極顯著性差異（P＜0．01）。

表1 各組細(xì)胞凋亡率［（±s）%］

表1 各組細(xì)胞凋亡率［（±s）%］

組別 n 凋亡細(xì)胞百分率P 10 13．34±2．51 0．001 ICH24h組 10 20．50±2．14 0．000 ICH72h組 10 37．76±4．05 0．000 ICH10d組 10 30．03±3．69 0．000對照組ICH6h組10 8．37±3．13

2 血腫周圍組織中p75NTR、TrkA的蛋白表達(dá)情況及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

2．1 免疫組化半定量分析結(jié)果：見表2。各實(shí)驗(yàn)組中p75NTR蛋白陽性表達(dá)率分別與對照組進(jìn)行比較均存在極顯著性差異（P＜0．01），p75NTR蛋白陽性表達(dá)率在ICH6h后顯著上升，72h達(dá)到高峰，10d有所下降；TrkA蛋白陽性表達(dá)率6h組及24h組與對照組比較無顯著性差異（P＞0．05）；72h組及10d組與對照組比較存在顯著性差異（P＜0．05）。

2．2 各蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系：p75NTR的陽性表達(dá)率與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢完全一致，二者之間呈極強(qiáng)正相關(guān)（r＝0．855，P＝0．000）；TrkA的陽性表達(dá)率與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢在72h前無明顯關(guān)系，72h后則相反，二者之間呈弱正相關(guān)（r＝0．399，P＝0．004）。

表2 免疫組化半定量分析結(jié)果（±s）%

表2 免疫組化半定量分析結(jié)果（±s）%

注：與對照組相比，＊P＝0．000；＃P＝0．558；△P＝0．662；P＝0．001；☆P＝0．001

陽性表達(dá)率6h組 10 31．31±3．65＊ 31．64±5．61組別 n p75NTR陽性表達(dá)率 TrkA＃30．39±3．95 24h組 10 44．19±6．53＊ 30．19±5．51△72h組 10 55．60±6．42＊ 36．79±3．17☆10d組 10 46．15±6．60＊ 41．60±4．23＊對照組 10 18．55±2．4＊

3 血腫周圍組織中p75NTR、TrkA的RNA表達(dá)情況及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

3．1 RT－PCR結(jié)果：見表3。各實(shí)驗(yàn)組分別與對照組間進(jìn)行比較，p75NTR的RNA相對表達(dá)量均存在極顯著性差異（P＜0．01），p75NTR基因的相對表達(dá)量在ICH6h后顯著上升，72h達(dá)到高峰，10d有所下降；TrkA基因的相對表達(dá)量6h組及24h組與對照組比較無顯著性差異（P＞0．05）；72h組及10d組與對照組比較存在極顯著性差異（P＜0．01）。

表3 各基因的相對表達(dá)量分析結(jié)果（±s）

表3 各基因的相對表達(dá)量分析結(jié)果（±s）

注：與對照組相比，＊P＝0．028；＃P＝0．000；△P＝0．856；☆P＝0．727

基因表達(dá)量6h組 10 1．17±0．29＊ 1．87±0．723組別 n p75NTR基因表達(dá)量 TrkA△10 0．83±0．35 1．82±0．42 24h組 10 2．36±0．70＃ 1．75±0．57☆72h組 10 5．04±1．52＃ 3．02±0．77＃10d組 10 4．39±1．50＃ 3．66±0．59＃對照組

3．2 各基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系：p75NTR基因的相對表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢完全一致，兩者之間呈極強(qiáng)正相關(guān)（r＝0．816，P＝0．000）；TrkA基因的相對表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率的變化趨勢在72h前無明顯關(guān)系，72h后則相反，兩者之間呈中等程度正相關(guān)（r＝0．595，P＝0．000）。

討 論

細(xì)胞凋亡是腦出血后血腫周圍組織中細(xì)胞死亡的主要形式［3］。Qureshi等［4］發(fā)現(xiàn)出血24h內(nèi)即可檢測到凋亡細(xì)胞，5d時(shí)仍有凋亡細(xì)胞的存在，凋亡細(xì)胞占血腫周圍死亡細(xì)胞的50%以上；我們之前的研究［5］發(fā)現(xiàn)血腫周圍組織中凋亡細(xì)胞率明顯高于血腫遠(yuǎn)隔部位組織。

p75NTR是一個(gè)分子量為75kD的單鏈跨膜I型糖蛋白，總長有427個(gè)氨基酸，是一種神經(jīng)營養(yǎng)素（Neurotrophins，NTs）受體，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段存在著廣泛的表達(dá)。近年來的研究顯示：p75NTR在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中具有促進(jìn)作用。研究證實(shí)：p75NTR可使體外培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、雪旺細(xì)胞及運(yùn)動神經(jīng)元發(fā)生凋亡，下調(diào)或者阻斷p75NTR的表達(dá)可以減少其凋亡；在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，神經(jīng)元的凋亡也與p75NTR有關(guān)，如在肌萎縮側(cè)索硬化、Alzheimer’s癥、脊髓損傷、腦損傷中，均存 在 p75NTR 表 達(dá) 的 增 加［6］。本 研 究 發(fā) 現(xiàn)：p75NTR表達(dá)的動態(tài)變化趨勢與細(xì)胞凋亡率完全一致，兩者之間呈極強(qiáng)正相關(guān)，這提示p75NTR在腦出血后的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著積極作用。

TrkA受體作為NGF的高親和力受體，具有神經(jīng)保護(hù)作用，Hempstead等［12］：發(fā)現(xiàn) NGF可以高親和力與TrkA結(jié)合從而維持細(xì)胞的存活及神經(jīng)元軸突的生長；TrkA受體的激活能夠?qū)π切捂呔兀⊿TS）誘導(dǎo)的海馬細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用，而使用K252a抑制TrkA受體后保護(hù)作用消失；Lu等發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)的TrkA的活化能夠介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的生存，而應(yīng)用TrkA的拮抗劑K252a則能阻斷其神經(jīng)保護(hù)作用；Bai等發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜損傷后TrkA的表達(dá)上調(diào)，TrkA受體被NGF激活后可起神經(jīng)保護(hù)作用。然而，p75NTR除了有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用外，還能與TrkA受體協(xié)作提高NGF與TrkA的親和力，促進(jìn)細(xì)胞存活和分化［7～9］。本研究結(jié)果顯示：TrkA受體的表達(dá)水平在腦出血后有不同程度的增加，在腦出血后72h內(nèi)，TrkA受體的表達(dá)是有一定程度的上調(diào)，但與對照組相比無顯著性差異，而此時(shí)處于上升趨勢，而在72h以后，TrkA受體水平繼續(xù)上調(diào)，與對照組相比有顯著性差異，細(xì)胞凋亡也在72h后出現(xiàn)下降趨勢，提示在72h前，TrkA受體的表達(dá)水平上調(diào)緩慢不足以拮抗p75NTR誘導(dǎo)的凋亡，隨后其表達(dá)明顯上調(diào)，逐漸發(fā)揮出其神經(jīng)保護(hù)作用，從而使細(xì)胞凋亡得以降低。

腦出血后的細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，其過程可能涉及到多種相關(guān)基因及蛋白，目前凋亡抑制劑在腦出血治療方面的研究已進(jìn)入動物實(shí)驗(yàn)階段，TNF－α，caspase－3，MMP－12是當(dāng)前腦出血后細(xì)胞凋亡通路中研究較多的靶點(diǎn)，這些研究結(jié)果顯示，部分凋亡抑制劑能夠改善腦出血后的細(xì)胞凋亡，從而減輕由細(xì)胞凋亡引起的腦出血后繼發(fā)性損傷。隨著研究的不斷深入，p75NTR、TrkA在腦出血后細(xì)胞凋亡過程中的作用機(jī)制將被進(jìn)一步闡明，這可為腦出血后的神經(jīng)保護(hù)及治療提供新思路及新途徑。

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