鳙魚肉酶解工藝及其產物清除羥自由基活性的研究

曹文紅，劉揚，洪英燕

（1.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東湛江524088；2.廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東湛江524088；3.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

活性氧自由基在體內主要有三種形式：·OH、O2-·和H2O2，它們是人體新陳代謝的副產物，可以與生物體內的許多物質如脂肪酸、蛋白質、核酸等作用，造成相關細胞結構和功能的破壞，在化學致癌過程中起著不可忽視的作用[1]。羥自由基·OH是體內最活潑的活性氧，攻擊能力最強，對機體危害最大，可介導許多病理變化，如引發不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，并損傷膜結構及功能，因此羥自由基的檢測對于自由基的生物作用研究具有重要意義[2]。眾多研究已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、動脈硬化以及人類免疫缺陷病毒（HIV）感染等均有密切關系。因此，如何清除自由基，防止氧化對生物體細胞和組織的破壞得到了普遍關注。尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來研究者們關注的課題，抗氧化肽也由此引起了人們的關注[3]。隨著對抗氧化的重視和對活性肽生理功能的認識，利用生物技術生產抗氧化肽的研究成為了當前的熱點。

近幾年來，國內外研究人員已從不同來源蛋白質中提取到各種具有抗氧化活性的肽類物質，如水產蛋白、乳酪蛋白、植物蛋白等[4-6]。特別是水產蛋白是制備抗氧化肽的良好蛋白源，目前已從鮭魚、鯖魚、羅非魚、泥鰍、鯖魚等眾多水產原料或其加工下腳料的蛋白質酶解產物中分離鑒定出具有抗氧化活性的肽類[7]。鳙魚是我國四大家魚之一，其營養價值雖高，但魚刺較多，泥腥味重，食用價值較低，加工利用較少，造成極大浪費。研究表明，某些氨基酸如 Glu、Met、Tyr、His、Lys、Pro等具有清除羥自由基的作用，那些表現出較強清除自由基活性的蛋白質水解肽，往往分子組成中含有這些氨基酸，而肽的清除自由基活性要強于相應的氨基酸[8-9]。楊品紅等在對幾種鳙魚肉蛋白質進行得營養成分分析中發現，Glu、Met、Tyr、His、Lys、Pro 接近占總氨基酸總量40%[10]。可以預計，通過適當控制酶解條件，可制備具有較強活性的鳙魚肉蛋白清除自由基活性肽。本課題以鳙魚肉為原料，通過實驗研究比較幾種酶的控制水解效果并比較酶解產物羥清除自由基的特性，篩選蛋白酶進行清除羥自由基活性酶解產物的制備，并檢測其分子量分布，旨在為下一步鳙魚抗氧化肽分離鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮮活鳙魚購于湛江霞山步行街肉菜市場，經去頭、去皮及去內臟后將血水和黑膜等清除清洗干凈，切塊后包裝于雙層聚乙烯袋中置于-18℃冷凍備用。

分子量標準：馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-Histidyl-Leucine，HHL，MW423u）購自日本 Peptide Institute；Triosephosphate-isomerase（MW26625u）、Myoglobin （MW16950u）、Aprotinin（MW6512u）、Insulin-B（MW3496u）、Bacitracin（MW1423u）購自美國 Biorad公司。

胃蛋白酶（1∶3000）、胰酶（1∶500）購自上海化學試劑公司；堿性蛋白酶Alcalase2.4L（2.4AU/g）購自諾維信公司；木瓜蛋白酶（ 300000 U/g）購自廣西南寧龐博生物工程有限公司；α-脫氧核糖購自美國Sigma-Aldrich公司；化學藥品均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FAT2104型電子分析天平：上海天平儀器廠；HHSZ1-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫療器械廠；TD5臺式離心機：長沙英泰儀器有限責任公司；PHS-25型酸度計：上海偉業儀器廠；DS-1型高速組織搗碎機：上海標本模型廠；JD-2型磁力攪拌器：上海理達儀器廠；UV-2501 PC型紫外分光光度計：上海尤尼科儀器廠；Waters 600E高效液相液相儀：美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選擇4種蛋白酶，在最適條件下（見表1）對鳙魚魚肉進行水解，測定不同時間的酶解產物水解度和羥自由基清除活性。

表1 各酶酶解的作用條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of the proteases used in enzyme selection

1.3.2 酶解處理

稱量鳙魚原料20 g→打漿均勻→定容到100 mL→調pH至設定值→加入設定蛋白酶→水浴→滅酶10 min→冷卻后調節pH至7.0→ 4000 r/min離心10 min→取上清液→置4℃下保存備用。

1.3.3 水解度的測定[11]

DH（%）=已水解的肽鍵數/原料中總肽鍵數×100%=[（B-C）/（A-D）]×100%

式中：A為原料中總氮量；B為水解液中的氨基氮量；C為原料游離的氨基氮量；D為原料中的非蛋白氮量。

1.3.4 清除羥自由基活性的測定[12]

取0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液（10 mmol/L）于具塞試管中，加入0.2mL的α-脫氧核糖溶液（20mmol/L），然后再加入0.2 mL酶解產物（2 mg/mL），并用磷酸緩沖液（pH 7.4）定容至1.8 mL，最后加入0.2 mL的H2O2（10 mmol/L），37℃水浴保溫1 h，然后加入1 mL 2.8%的三氯乙酸終止反應，再加入1 mL 1%的硫代巴比妥，混勻后沸水浴中加熱10 min，冷卻后稀釋5倍于532 nm處測光吸收值As。不加樣品，同上操作處理，測定其對比吸光值Ac。樣品的自由基清除能力（ScavengingActivity，SA）可表示為：SA（%）=（As-Ac）/As。

1.3.6 正交試驗法優化酶解工藝

為了獲得最高羥自由基清除活性的鳙魚肉酶解產物，對酶解溫度、pH、酶量、3個主要因素進行正交優化，時間固定為3 h，底物濃度固定為20%（W/V）。根據單因素實驗結果（數據未列出）選擇因素水平（見表2），以羥自由基的清除率作為衡量指標，利用L9（34）正交表進行優化實驗。

表2 正交試驗因素水平編碼表Table 2 Levels and codes of the factors in the orthogonal design

1.3.7 酶解產物分子量分布的測定

采用高效體積排阻色譜（HPSEC）法測定鳙魚肉最優酶解工藝條件的酶解液的分子量分布，流動相為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.3）。將6種分子量標準 多 肽 （Triosephosphate-isomerase、Myoglobin、Aprotinin、Insulin-B、Bacitracin 和 HHL）配制成溶液，上樣10 μL至WatersPROTEIN-PAK 60柱進行高效液相色譜洗脫（Waters 600E，美國Waters公司），流動相流速0.7 mL/min，監測214 nm處的吸光值，建立分子量M的對數與洗脫保留時間t之間的回歸方程為分子量。將酶解液經過針式過濾頭（0.45 μm）過濾后在相同的條件下進行高效液相色譜洗脫，利用分子量回歸方程考察分子量分布。將分子量標準物質的保留時間t和分子量的對數LgM在平面坐標系中描點，回歸得到分子量標準曲線，得到分子量回歸方程為LgM=-0. 2261t+6. 4872，決定系數為0. 9837，說明兩者線性相關性及回歸性良好。

1.3.8 平均肽鏈長度的計算

由于蛋白質20種氨基酸的平均分子量為128，除去氨基酸與氨基酸縮合成肽鍵時生成的水分子，即可得平均肽鏈長度＝分子量大小/（128-18）＝分子量大小/110。

2 結果與分析

2.1 酶篩選結果

蛋白酶對蛋白質底物的肽鍵具有一定專一性，因此表現出相同蛋白酶對不同蛋白質的水解效果不同，不同蛋白酶對相同蛋白質的水解效果亦不同。蛋白酶對蛋白質水解的效果則體現在蛋白質被水解的程度及水解產物的組成上。水解產物組成的不同又決定了該產物體現的功能特性和生物活性的不同。因此，在活性肽的制備中，酶的篩選及其工藝參數的確定十分重要。本研究嘗試利用生物酶法制備鳙魚肉蛋白清除自由基活性肽，以胃蛋白酶、Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶等四種4種包括酸性酶、中性酶和堿性酶的動物、植物或微生物來源的蛋白酶進行篩選制備用酶。

胃蛋白酶、Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶4種蛋白酶在酶解時間2、4、6 h時的鳙魚肉酶解產物的羥自由基清除活性及水解度見圖1。

從圖1（a）中可看出，各酶酶解產物均具有一定的羥自由基清除活性。Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶的鳙魚肉酶解產物對羥自由基的清除活性（2 mg/mL濃度下檢測）比較高，平均在60%以上，而胃蛋白酶的酶解產物清除活性較低，平均40%左右。同時，由圖1（b）可知木瓜蛋白酶酶解產物水解度最大，平均達28%，Alcalase2.4L、胰酶酶解產物水解度平均都低于20%，胃蛋白酶酶解產物的水解度平均為12%左右。故通過本實驗，在羥自由基清除活性相當的情況下，選擇水解度較大的酶―木瓜蛋白酶作為鳙魚肉清除羥自由基酶解產物的用酶。當水解時間為2 h時，清除能力可達65.78%。各酶酶解產物的水解度和羥自由基清除活性并不隨酶解時間而提高，未呈規律性。木瓜蛋白酶是一種內切蛋白酶，專一性強，酶解蛋白質容易產生短肽[13]。

2.2 木瓜蛋白酶酶解工藝的正交優化

正交試驗設計可很好地進行多因素多水平試驗的工藝參數優化，實現提高活性、得率及降低消耗等研究目的。本研究利用L9（34）的正交試驗考察pH、溫度、酶量等對鳙魚肉酶解產物羥自由基活性的影響，優化木瓜蛋白酶酶解工藝參數。酶解時間固定為3 h，底物濃度為20%，考察指標為羥自由基清除率。

正交試驗設計及結果如表3所示。

表3 正交試驗設計結果與分析Table 3 Results and analysis of the orthogonal design

由表中極差分析結果表明，影響木瓜蛋白酶酶解產物對羥自由基清除作用的各因素排列順序是C＞A＞B。由正交試驗結果可以得到木瓜蛋白酶酶法制備鳙魚肉羥自由基清除活性產物的優化酶解條件是A1B1C2，確定的最佳優化條件為：45℃，pH 7.0，酶加量2%，時間3 h，底物濃度20%。在該條件下，鳙魚肉酶解物的羥自由基清除率達76.13%（2 mg/mL）。這表明經過水解之后，鳙魚肉酶解產物對自由基表現出較好的清除效果，提示酶解產物中存在較強的羥自由基清除活性物質。

2.3 酶解產物的分子量分布

蛋白質酶解產物的分子量分布可反映其組成情況。HPSEC已經成功地應用于果膠、寡聚半乳糖醛酸等多糖及其衍生物的分子質量測定，它能分離相對分子質量差別在10%以上的分子[14]。蛋白質酶解產物組分相對分子質量的變化是連續的，雖不能用HPSEC進行分離，但可測定其相對分子質量的分布情況。

在正交試驗設計的優化條件下制備木瓜蛋白酶鳙魚肉的酶解產物下進行HPSEC分析，如圖2所示。

圖2 鳙魚肉木瓜蛋白酶酶解產物HPSEC圖譜Fig.2 HPSEC of the papain hydrolysate of variegated carp meat under optimized condition

在紫外波長214 nm條件下得到9個主要的吸收峰。根據分子量分布，峰1、峰2和峰3的肽鏈長度在294.2～51.1之間，該組分主要是蛋白質。峰8和峰9組分主要是小肽和氨基酸，平均肽鏈長分別為4.0～2.3，2.3～0.3。而峰 4 肽鏈長度為 51.1～24.5，峰 5、6、7 組分的肽鏈長度在24.5～4.0之間。峰5至峰9這部分組分（2691～32 u）占酶解產物的65%，這表明鳙魚肉酶解產物中具有較強羥自由基清除活性的主要是短肽產物（表4）。

表4 用于鳙魚肉木瓜蛋白酶酶解產物的分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of the papain hydrolysate of variegated carp meat

3 結論

1）利用胃蛋白酶、Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶4種常用蛋白酶制備鳙魚肉酶解液，測定酶解時間2、4、6 h時的鳙魚肉酶解產物對羥自由基的清除活性和水解度，其中木瓜蛋白酶酶解效果最好，其水解度平均達28%，羥自由基清除率平均達65.78%。

2）通過對酶解溫度、pH、酶量3個主要因素進行正交優化試驗設計，得到鳙魚肉酶解液清除羥自由基活性最佳酶解工藝條件為：木瓜蛋白酶用量2%，溫度為45℃，pH為7.0，酶解時間為3 h，底物濃度20%，在該條件下羥自由基清除率為76.13%。

3）利用木瓜蛋白酶酶解鳙魚肉制備具有較高活性的清除羥自由基活性酶解產物，經高效體積排阻色譜分離，得到9個吸收峰。分子量分布范圍2691～32 u的組分占酶解產物的65%，表明鳙魚肉酶解產物中具有清除羥自由基清除活性的主要是短肽產物。

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