苦菜蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化

霍莉，王頡

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071001；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

苦菜為菊科苦苣屬多年生草本植物，無(wú)毛，折斷有白汁，耐寒、耐熱、耐旱、耐瘠薄性均較強(qiáng)，廣泛分布于全國(guó)各個(gè)地方。全草含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，無(wú)毒，有抗菌、解熱、消炎、解毒等作用[1-4]，尤其可解尼古丁之毒[5-6]，為探究苦菜和尼古丁作用機(jī)理，需提取其主要成分。而苦菜蛋白也和其他植物蛋白一樣，不含膽固醇，容易消化，有良好的抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝、抗衰老等作用[7-9]，現(xiàn)對(duì)其利用只局限在飼料，仍有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。植物蛋白提取方法有加熱、酸化加熱或堿化加熱凝聚法、酶法、鹽析法[10-13]。苦菜蛋白提取少有研究，采用鹽溶，超聲、酸熱綜合方法提取苦菜蛋白質(zhì)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考查料液比、加鹽量、pH、絮凝溫度等4個(gè)因素對(duì)苦菜蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為實(shí)際提取苦菜蛋白的提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦菜（山苦荬）：采于河北保定田間；鮮苦菜→洗凈→自然晾干→高速粉碎成粉末狀；硫酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、無(wú)水硫酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、硼酸、鹽酸均為分析純。混合指示劑：V（溶解于95%乙醇的0.1%溴甲酚綠溶液）：V（溶于95%乙醇的0.1%甲基紅溶液）＝5∶1。

消解爐，凱氏定氮儀（KDY-9810）：北京通潤(rùn)源機(jī)電有限公司；超級(jí)恒溫水浴：上海精密科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；烘箱：上海申賢恒溫儀設(shè)備器廠；FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；B3200S-T型超聲波清洗器：杭州旭東升科技有限公司；pHS-3CW酸度計(jì)：上海理達(dá)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的測(cè)定

按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定（GB 5009.5—2010），凱氏定氮法測(cè)定苦菜蛋白質(zhì)含量。取0.5 g樣品粉末放入定氮瓶中，加入W（CuSO4）：W（K2SO4）=1 ∶3 混合物 6 g，再加入 10 mL 濃 H2SO4，消煮至溶液呈透明的藍(lán)綠色，冷卻，加入10 mL蒸餾水稀釋。打開(kāi)凱式定氮儀，將消煮管固定于加堿處，加稍過(guò)量的400 g/L的NaOH溶液（約40 mL）。將加有20 mL 2%硼酸溶液和1滴～2滴混合指示劑的錐形瓶放在蒸餾托盤上，按蒸餾鍵進(jìn)行蒸餾，當(dāng)冷凝管口的冷凝液呈中性時(shí)（pH紙測(cè)定）即為蒸餾終點(diǎn)；取下錐形瓶，再滴加1滴混合指示劑，用已標(biāo)定的HCl溶液進(jìn)行滴定，溶液由淺綠色變?yōu)闇\紅色時(shí)即為滴定終點(diǎn)。蛋白含量（g/100 g）=[CHCl（V-V0）×0.014×6.25]×100/m。測(cè)定苦菜粗蛋白含量平均為21.11%。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

蛋白提取步驟為：鹽溶→超聲→離心→調(diào)pH→加熱沉淀→離心→干燥→稱重。

操作要點(diǎn)：由于蛋白質(zhì)分子表面帶有電荷，低濃度中性鹽鹽離子可促使蛋白質(zhì)溶解，為了方便食用，采用NaCl作為鹽，超聲可縮短提取時(shí)間。綜合采用蛋白質(zhì)提取率高，凝集迅速的酸熱法，用鹽酸調(diào)pH，再加熱沉淀，離心干燥得到苦菜蛋白粉。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取率計(jì)算公式

蛋白質(zhì)提取率（%）=（苦菜蛋白質(zhì)提取絕對(duì)干重/苦菜粗蛋白含量）×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比的影響

稱取的5g苦菜粉末，料液比分別為1∶10、1∶15、1 ∶20、1∶25、1 ∶30，以加鹽（NaCl）量為 1%，超聲 30 min（可大大節(jié)省提取時(shí)間，文獻(xiàn)加熱提取需浸泡24 h[10]），離心，取上清液，以1 mol/L的稀鹽酸調(diào)pH3.0于60℃下加熱10 min，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，棄上清液，50℃下烘箱干燥，回潮后稱重。結(jié)果見(jiàn)圖1。

當(dāng)料液比為1∶15，1∶20蛋白提取率較高，分別為44.62%和44.76%，其他配比蛋白提取率都較低，顯然料液比有最佳范圍。加水少，苦菜蛋白溶解不充分；加水多，沉淀不完全，易損失。

圖1 料液比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.1 Impacts of the ratio of ixeris chinensis to water

2.1.2 提取液pH的影響

用1mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH分別為2.7、3.0、3.3、3.6、3.9，料液比 1 ∶20，加鹽量為 0.6%，絮凝溫度為60℃進(jìn)行試驗(yàn)，其他操作同2.1.1，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 Impacts of pH

當(dāng)pH為3.0時(shí)達(dá)到最大（27.00%），且pH＞3.0蛋白提取率下降。所以選擇pH為3.0。

2.1.3 絮凝溫度的影響

設(shè) 60、65、70、75、80 ℃ 5 個(gè)不同水平，料液比為1∶20，pH3.0，加鹽量為0.6%下進(jìn)行試驗(yàn)，其他操作同2.1.1，見(jiàn)圖 3。

圖3 絮凝溫度對(duì)蛋白提取率的影響率的影響Fig.3 Impacts of flocculation temperature

說(shuō)明苦菜蛋白提取率隨溫度升高顯著增大，到70℃達(dá)最大值（27.57%），70℃以后蛋白提取率升高不大，Julius.K等[14]對(duì)植物蛋白提取所需要的熱能進(jìn)行研究，可以估算提取葉蛋白的溫度范圍。

2.1.4 加鹽量的影響

加鹽量分別為 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，以料液比為1∶20，pH3.0，絮凝溫度60℃，其他操作同上，見(jiàn)圖4。

圖4 加鹽量對(duì)蛋白提取Fig.4 Impacts of Adding salt

圖4結(jié)果表明隨加鹽量增加苦菜蛋白提取率為先增加后減少，當(dāng)加鹽量為0.8%時(shí)，蛋白提取率出現(xiàn)最佳值（32.49%）。低濃度Cl-可促使蛋白質(zhì)溶解，但濃度過(guò)高，會(huì)引起鹽析。開(kāi)始考察加鹽量大于1%時(shí)，蛋白提取率顯著下降，可能與苦菜自身蛋白質(zhì)顆粒大小、組成和親水性有關(guān)。

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素考察苦菜蛋白提取條件基礎(chǔ)上，采用四因素（料液比、加鹽量、pH值、絮凝溫度）三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化苦菜蛋白質(zhì)的提取工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表 2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal experiment

正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果表明，影響苦菜蛋白質(zhì)提取率的因素主次順序?yàn)椋杭欲}量＞pH＞料液比＞絮凝溫度；最佳提取工藝為：加鹽量1.0%，pH3.0，料液比1∶25 g/L，絮凝溫度65℃。在此條件下，苦菜葉蛋白的提取率可達(dá)49.36%。

2.3 粗蛋白中蛋白含量

取提取的粗蛋白0.5 g若干份，方法同1.2.1，凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白中蛋白含量均為53.7%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Rusults of orthogonal experiment

3 結(jié)論

苦菜含有豐富的種類均衡的氨基酸的蛋白質(zhì)[15]，苦菜蛋白功用還有待深入研究，而苦菜蛋白提取是基礎(chǔ)。

以苦菜蛋白提取率大，操作簡(jiǎn)便為目的，采用了鹽溶、超聲、酸熱綜合方法提取苦菜蛋白質(zhì)，提取時(shí)間大大縮短，得到影響粗蛋白提取率的因素依次為加鹽量＞pH值＞料液比＞絮凝溫度；最佳提取工藝為：加鹽量1.0%，pH值3.0，料液比1∶25 g/L，絮凝溫度65℃。在此條件下，苦菜葉蛋白的提取率可達(dá)49.36%。

[1] 霍碧姍,秦民堅(jiān).苦苣菜屬植物化學(xué)成分與藥理作用[J].國(guó)外醫(yī)藥.植物藥分冊(cè),2008,23(5)：203-207

[2] 劉勝民,謝衛(wèi)東,孟凡君.苦荬菜屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(4)：975-977

[3] Trinh,Hien-Trung,Eun-Ah Bae,Yang-Jin Hyun,et al.Antiallergic Effects of Fermented Ixeris sonchifolia and Its Constituents in Mice[J].J.Microbiol Biotechnol,2010,20(1)：217-223

[4]S Zhang,M Zhao,L Bai,et al.Bioactive guaianolides from siyekucai(Ixeris chinensis)[J].Journal of Natural Products,2006,69(10)：1425-1428

[5] 王頡,王茜,石磊,等.一種減少煙草中尼古丁的方法.中國(guó),200810084227.3[P].2008-10-08

[6] 趙云玲,李華洲.中華苦荬菜抗煙堿作用研究[J].動(dòng)物毒物學(xué),2003,18(1/2)：69-70

[7] Wang J C,Kinsella J E.Functional Properties of novel proteins：al－faleaf protein[J].Journal of Food Science,1976,41(2)：286-292

[8] Pandey V N.Leaf protein content and yield of some Indian legumes[J].Plant Foods for Human Nutrition,(Formerly Qualitas Plantarum),1994,46(4)：313-322

[9] 呂宗友,趙國(guó)琦,蘇衍菁,等.白三葉葉蛋白提取及純化工藝[J].草業(yè)科學(xué),2011,28(11)：2052-2056

[10]李明元,文李鈴,杜小琴.可食苜蓿葉蛋白提取工藝研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2008,33(3)：69-72

[11]賀新強(qiáng),宋葆華,倪陳凱.植物葉蛋白提取方法的比較[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),1999,8(2)：63-64

[12]仵昱舟,馮翠萍.酶法提取葡萄籽中蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2010,31(2)：63-66

[13]白紅杰,包豐艷,格根圖.酸熱法提取苦荬菜葉蛋白初探[J].內(nèi)蒙古草業(yè),2009,21(3)：49-52

[14]Julius K Tangka.Analysis of the Thermal Energy Requirements for the Extraction of Leaf Protein Concentrate from some Green Plants[J].Biosystems Engineering,2003,86(4)：473-479

[15]霍莉,陳萍,彭松,等.苦菜不同部位蛋白質(zhì)和氨基酸含量分析[J].食品工業(yè)科技,2013,34(19)：341-348