誘導植物乳桿菌生物膜形成的環境因素探索*

任曉鏷，李明楊，任少東，王群霞

1(塔里木大學 生命科學學院，新疆阿拉爾，843300)

2(新疆南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾，843300)

3(新疆阿拉爾質量技術監督綜合檢測檢驗所，新疆阿拉爾，843300)

細菌生物膜是指由細菌本身分泌的多聚基質包裹、能黏附于某種有生命或者無生命固體表面的一種有結構的群體，這是一種保護性的生長模式，它使細菌能夠在惡劣環境下存活［1］。所有的微生物均能夠形成生物膜［2］。細菌生物膜的形成是一個極為復雜的過程，受到外界各種因素的影響。不同的微生物，不同的因素均對生物膜的形成有重要影響。李延榮等［3］曾對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響因素進行過探索，表明金葡菌生物膜的形成存在不依賴于細菌數量的機制，NaCl及葡萄糖能夠在不影響細菌生長的條件下促進其生物膜的形成。任曉鏷等［4］曾經對表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜的形成有過研究，其結果顯示NaCl、高于0.2%的Ca2+以及8%及以上濃度的乳糖均對表葡菌生物膜的形成有明顯的抑制作用。李靜等［5］對糞腸球菌生物膜形成及其影響因素進行了分析，發現培養時間為36 h，培養溫度為37℃，生物膜引導材料為乳膠時生物膜內活菌數最多。真菌也能夠形成生物膜使其更適應于環境。任曉萍等［6］對真菌生物膜形成的影響因素進行了綜述，指出碳源、唾液、氧氣、酸堿、溫度及真菌種類均對其生物膜的形成影響巨大。長久以來，國內外研究人員對病原微生物生物膜形成的影響因素探討較多，而對于有益生物膜的研究較少。Morikawa［7］曾對枯草芽孢桿菌有益生物膜對人類的貢獻進行了綜述，他指出有益生物膜在作為生防試劑、生物反應器及生物修復等方面起著重要作用。吳迪等［8］將固定化微生物生物膜技術應用于處理農村生活污水，較大程度地除去了污水中的有機物質，使污水處理與利用結合得更加緊密。張正等［9］則是將微生物生物膜應用于水產養殖業，他指出依靠富集有益微生物所形成的生物膜，通過微生物的新陳代謝作用實現對養殖廢水中有害物質的降解和去除，進而達到水質凈化的目的。乳酸菌作為公認安全細菌，其胞外代謝產物均為公認安全，因此該類細菌所形成的生物膜有著巨大的開發研究潛力，深入研究并開發利用其特性成為必然趨勢。同其他微生物一樣，乳酸菌生物膜的形成也受到各種外界環境因素的影響。植物乳桿菌是一種常見于乳制品、肉類及蔬菜發酵制品中的乳酸菌，與人類的關系極為密切，對腸道微生物有重要影響，能夠通過胃并定植于人體腸道發揮有益作用［10］。無論在食品發酵、工業乳酸發酵，還是醫療保健等領域，都有著極為廣泛的應用。本文旨在探索1株分離自新疆傳統乳制品——酸奶疙瘩并且不能形成生物膜的植物乳桿菌，尋找外界環境因素中是否存在能夠誘導其生物膜形成的條件，使乳酸菌的有益生物膜更廣泛地應用于食品領域。

1 材料方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗菌株

生物膜形成強陽性標準菌株——表皮葡萄球菌ATCC 35984，生物膜陰性乳酸菌——植物乳桿菌10#。

1.1.2 儀器及試劑

Absorbance Microplate Reader(Bilog，ELx808)，96孔板(Labphil Biotechnology)，移液器(Eppendorf AG)，MRS肉湯培養基(北京奧博星生物技術有限公司)，葡萄糖、NaCl、CaCl2、MgCl2、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、H3PO4、麥芽糊精及明膠等均為國產分析純。

1.1.3 微量板半定量法檢測細菌生物膜的形成

根據Christensen等的方法［11］并略做改動。按1∶100的接種比例將過夜培養的菌液30 μL，接種至3 mL培養基中，振蕩搖勻后，吸取200 μL至96孔細胞培養板中，每株接種5孔;剩余3孔為對應空白對照(等體積的相應空白液體培養基);同時每一培養板中設陽性對照(ATCC 35984)。37℃恒溫靜置培養48 h后，取出培養板用Microplate Reader測定其生長濁度OD590值，然后輕輕拍出培養液，無菌水洗板4次，每次振搖30下左右，以洗去未黏附細菌。56℃烘干固定1 h，50 μL 0.5%結晶紫染色5 min，自來水沖洗除去多余染液，37℃晾干，再用Microplate Reader測定其生物膜形成OD490值。所有生物膜形成檢測實驗均在不同時間重復3次。

1.1.4 不同理化因素對植物乳桿菌生物膜形成的誘導

1.1.4.1 不同接種量

按不同的接種比例(1∶1、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000)將培養過夜的細菌母液接種至3 mL液體培養基中，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.4.2 不同培養溫度

按1.1.3所述將上樣好的96孔板分別置于不同的溫度(20、28、37、42 ℃)靜置培養48 h，然后再檢測其生物膜的形成。

1.1.4.3 不同培養時間

按1.1.3所述將上樣好的96孔板置于37℃條件下分別培養不同的時間(8、16、24、48、72 h)，然后檢測其生物膜的形成。

1.1.4.4 不同濃度葡萄糖

在細胞培養板中分別加入以含不同質量分數(0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)葡萄糖的液體培養基200 μL，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.4.5 不同濃度NaCl

在細胞培養板中分別加入以含不同質量分數(0、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)NaCl的液體培養基200 μL，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.4.6 不同pH值

按1.1.3所述分別將液體培養基調為不同的pH(1.8、2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8、9.8、10.8)，再檢測其生物膜的形成。

1.1.4.7 不同濃度Ca2+和Mg2+

在細胞培養板中分別加入以含不同質量分數(0、0.5%、1.0%、1.5%)Ca2+與 Mg2+的液體培養基200 μL，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.5 不同食品添加劑對植物乳桿菌生物膜形成的誘導

1.1.5.1 不同濃度乳酸

在細胞培養板中分別加入以含不同體積分數(0、0.2% 、0.4% 、0.8% 、1.2% 、1.6% 、2.0% 、3.0%)乳酸的液體培養基200 μL，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.5.2 不同濃度檸檬酸

在細胞培養板中分別加入以含不同體積分數(0、0.2% 、0.4% 、0.8% 、1.2% 、1.6% 、2.0% 、3.0%)檸檬酸的液體培養基200 μL，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.5.3 不同濃度H3PO4

在細胞培養板中分別加入以含不同體積分數(0、0.2% 、0.4% 、0.8% 、1.2% 、1.6% 、2.0% 、3.0%)磷酸的液體培養基200 μL，按照1.1.3所述檢測細菌生物膜的形成。

1.1.5.4 不同濃度麥芽糊精

在細胞培養板中分別加入以含不同質量分數(0、2.0%、5.0%、8.0%、12.0%、15.0%、18.0%)麥芽糊精的液體培養基稀釋的菌液200 μL，按1.1.3所述檢測生物膜形成。

1.1.5.5 不同濃度明膠

在細胞培養板中分別加入以含不同質量分數(0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%)明膠的液體培養基稀釋的菌液200 μL，按1.1.3所述檢測生物膜形成。

2 實驗結果

2.1 不同理化因素誘導植物乳桿菌生物膜的形成

從圖1可以看出，不同的理化條件對植物乳桿菌的生長影響各不相同，并且對該細菌生物膜形成的誘導情況也各異。細菌母液接種量在1∶1～1∶1 000變化時，細菌的生長情況變化不大，各比例的接種量也對其生物膜的形成無明顯誘導作用(如圖1a);該細菌在所選擇4個溫度梯度條件下，細菌的生長及其生物膜均無明顯變化(如圖1b);細菌培養時間的縮短及延長對其生長及生物膜的形成無明顯影響(如圖1c);葡萄糖的添加能夠顯著提高細菌的生長量(P＜0.05)，并且隨著濃度的增高呈增高趨勢，尤其當葡萄糖濃度達到6.0%及以上時，相對于2.0%濃度其生長量顯著增高(P＜0.05)，而葡萄糖的加入對細菌生物膜的形成卻無影響(如圖1d);8%及以上的NaCl能夠顯著抑制該細菌的生長(P＜0.05)，而在NaCl濃度低于6%時，對生長無明顯影響。但是，當NaCl濃度在6%時，能夠顯著誘導植物乳桿菌形成強陽性生物膜(P＜0.05)，其他各濃度NaCl均無此作用(如圖1e)。不同pH對細菌的生長及對生物膜形成的誘導作用也不相同，當初始培養液的pH在4.8～8.8之間時，細菌的生長基本未受到明顯影響。同時，pH為4.8和5.8時，具有誘導植物乳桿菌形成弱陽性生物膜的作用(如圖1f)。在所選濃度范圍內，Ca2+和Mg2+均對細菌的生長和生物膜的形成無明顯影響(如圖1g)。

2.2 不同食品添加劑誘導植物乳桿菌生物膜的形成

從圖2可以看出，不同的食品添加劑對植物乳桿菌的生長及對其生物膜的誘導方面各不相同。低濃度的乳酸(0.2%)的加入即可顯著抑制細菌的生長(P＜0.05)，對其生物膜也無任何誘導形成的作用(如圖2a);而其他2種食品添加酸——檸檬酸和H3PO4，在較低濃度條件下能夠對細菌的生物膜起到一定的誘導作用。當檸檬酸濃度為0.2%～0.8%時，細菌能夠形成弱陽性的生物膜(如圖2b);而H3PO4誘導其形成弱陽性生物膜的范圍為0.2%～0.4%(如圖2c)。經t檢驗分析，2種有機酸對細菌生物膜形成的誘導作用存在一定差異，0.2%的檸檬酸能夠達到顯著水平(P＜0.05)，而0.2%濃度的H3PO4誘導生物膜形成的水平不顯著。當2種酸濃度達到一定濃度時(高于1.2%)，對細菌的生長有顯著抑制作用(P＜0.05)。麥芽糊精對細菌的生長及生物膜的形成均無影響(如圖2d);而明膠卻能夠在不影響細菌生長的情況下誘導細菌形成弱陽性的生物膜(P＜0.05)(如圖2e)。

3 討論

圖1 不同的理化因素對植物乳桿菌生物膜形成的誘導Fig.1 Effects of different physical and chemical factors on biofilm formation by Lactobacillus plantarum

圖2 不同的食品添加劑對植物乳桿菌生物膜形成的誘導Fig.2 Effects of different food additives on biofilm formation by Lactobacillus plantarum

乳酸菌是一類能夠利用可發酵性糖類產生大量乳酸的細菌總稱，它與人類的關系極為密切。乳酸菌代謝產物乳酸、胞外多糖及細菌素等廣泛應用于食品及醫藥等領域，人類利用乳酸菌的歷史可以追溯到5 000多年前［12］。許多乳酸菌是人體胃腸道固有有益菌叢，起著改善腸道內環境、抑制致病菌生長的作用，并且能夠維持胃腸道微生態平衡，提高機體免疫力等功能［13］。細菌生物膜通常作為常見致病菌耐藥性產生的主要原因之一，而人們往往忽略了生物膜對人類有益貢獻的另一方面。充分將細菌生物膜的特性利用以為人類作更大的貢獻成為一種必然趨勢。例如枯草芽孢桿菌生物膜已被用作生物反應器、作為生防試劑及生物修復等方面;乳酸菌生物膜的應用也開始嶄露頭角，Atsumu等［14］已將乳酸菌與酵母菌共生形成的混合生物膜應用于發酵生產乙醇，并指出該種混合生物膜對細胞固定化技術的發展有極大推進作用。因此，深入探索誘導乳酸菌生物膜形成的各種外界環境條件，有助于進一步開發利用乳酸菌生物膜。

本文研究了1株分離自新疆傳統乳制品——酸奶疙瘩中的植物乳桿菌，它是生物膜陰性乳酸菌，本研究探索了不同的外界環境條件對其生物膜形成的誘導。結果表明，接種量、培養時間、培養溫度、葡萄糖、Ca2+、Mg2+等理化因素均對該植物乳桿菌生物膜的形成無誘導作用;而乳酸及麥芽糊精也對其生物膜的形成無影響。在理化因素中，6%NaCl能夠顯著誘導該細菌生物膜的形成(P＜0.05)，而其他各濃度的NaCl均無此誘導作用。這可能是因為6%NaCl能夠激活調控其生物膜形成的基因，進而誘導生物膜的形成。NaCl的這種誘導作用早在2001年就被提出過，Knobloch等［15］曾指出，NaCl能夠抑制表皮葡萄球菌icaR基因(阻遏生物膜形成的基因)的表達，激活SigB和RsbU因子，進而誘導生物膜的形成;Rode等［16］證明NaCl對金葡菌生物膜的形成具有顯著增強作用，這進一步驗證了NaCl特有的誘導作用。有學者［17］指出，pH值在微生物生物膜的形成過程中起著至關重要的作用。這個作用可能是通過影響電子轉移而達到對生物膜的影響的。適合于生物膜形成的pH范圍很窄，并且不同的微生物其范圍不同。在本研究中，當pH為4.8～5.8時，植物乳桿菌能夠被誘導形成弱陽性的生物膜。同樣，當加入食品添加酸類的濃度達到0.4%時，培養液的pH約為5.6，弱陽性的生物膜也被誘導形成。這兩者前后呼應，說明在某個范圍的pH能夠起到誘導乳酸菌形成弱陽性生物膜的作用。明膠是水溶性蛋白質混合物，是一種無脂肪的高蛋白且不含膽固醇的天然營養型食品增稠劑，其主要組成為氨基酸組成相同而分子質量分布很寬的多肽分子混合物，組成明膠的蛋白質中含有18種氨基酸，蛋白質的含量高達82%以上，另外還含有16%的水和無機鹽。國內外有關明膠與微生物生物膜的研究多是利用生物膜作為生物反應器進行明膠的水解，關于采用明膠作為微生物生物膜形成的誘導劑尚無研究。從本研究結果可以看出，明膠能夠誘導植物乳桿菌形成弱陽性的生物膜，這可能是因為明膠具有較好的增稠效果，能夠粘連細菌胞外多糖而發生聚集，進而形成生物膜。

從以上結果可以看出，各種不同的外界環境條件對細菌生物膜形成的誘導作用各不相同，在本研究中6%的NaCl能夠誘導植物乳桿菌形成強陽性的生物膜，酸環境以及明膠也能夠誘導該細菌形成弱陽性的生物膜，但是可能對其他種類的微生物，誘導其形成生物膜的因素又會發生改變，因為生物膜形成的影響因素眾多且復雜。無論是哪種因素對其生物膜的誘導作用，其誘導機理均為推測，具體調控機制尚不清楚，需要進一步探索和研究。

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