賴氨酸/葡萄糖美拉德反應產物對丙烯酰胺生成的抑制作用*

郝瑞芳，景浩

1(山西林業職業技術學院 園藝系，山西太原，030009)2(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京，100083)

丙烯酰胺(acrylamide，AA)是一種公認的具有神經毒性和潛在致癌性的物質，已被國際癌癥研究總署列為“人類可能的致癌物”(2A類)［1］。淀粉含量高的油炸或焙烤類食品(如炸薯條、薯片、面包、餅干等)中含有較多的丙烯酰胺，其形成主要是食品中的天冬酰胺(asparagine，Asn)和還原糖(如葡萄糖、果糖)在高于120℃的條件下加熱，通過美拉德反應而生成，且隨著加熱溫度的升高，丙烯酰胺的生成明顯增加［2-3］。

研究表明添加抗氧化劑如原花青素、兒茶素和生物黃酮均能夠顯著抑制模擬體系和谷物、馬鈴薯等食品體系中丙烯酰胺的生成［4-6］。已有研究證明，美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)具有較強的抗氧化性，它是食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質)的ε-氨基與羰基化合物(糖類、醛、酮等)的羰基之間發生反應生成的產物［7］。景浩等［8-9］研究表明，葡萄糖和核糖分別與賴氨酸和甘氨酸的美拉德反應產物能夠阻止亞油酸乳化體系中脂質過氧化，能夠清除DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基、過氧化物。將賴氨酸/葡萄糖美拉德反應產物分成高分子質量和低分子質量的產物(high and low molecular weight-lysine/glucose Maillard reaction products，H-MRPs and L-MRPs)2部分，并比較其抗氧化性。結果顯示:H-MRPs表現出更強的抗氧化性，對羥自由基和DPPH自由基的清除能力強于LMRPs［8］。

因此本試驗以高、低分子質量的賴氨酸(Lysine，Lys)/葡萄糖(glucose，Glc)美拉德反應產物(H-LGP和L-LGP)為添加物，探討其對天冬酰胺/葡萄糖模式體系中丙烯酰胺的生成是否有抑制作用，同時測定模式體系的吸光值和對自由基的清除作用，考察添加物對天冬酰胺/葡萄糖模式體系的褐變程度和抗氧化性的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SPD-20A型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，配紫外檢測器;Thermo Hypersil ODS C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 mm，美國Thermo公司);680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

丙烯酰胺標準品，純度99.5% ，購自德國 Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司，賴氨酸和天冬酰胺，購自北京拜爾迪生物公司;其他藥品均為國產分析純。丙烯酰胺儲備液濃度1.0 mg/mL;磷酸鹽緩沖液配制:稱取 KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.90 g，KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，加900 mL 去離子水溶解，用18%的HCl調pH值至7.4，最后定容至1 L。

1.2 實驗方法

1.2.1 反應體系的確立

(1)賴氨酸/葡萄糖美拉德反應產物(LGP)的制備:準確稱取Lys 1.46 g，Glc 1.98 g，置于100 mL的容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，調溶液pH為8.0，最后定容至100 mL，使Lys與Glc的終濃度均為0.1 mol/L。將配好的待反應溶液加入耐高壓玻璃管中，密閉管口并置于油浴鍋中，于150℃加熱30 min，制備LGP。反應體系的溫度用紅外測溫儀測量。反應結束后迅速將玻璃管放入冰水混合浴中終止反應。在LGP中加入9倍體積的無水乙醇，攪拌，于5 000×g離心10 min，收集上清液和沉淀兩部分，上清液為低分子質量的LGP(L-LGP)，沉淀為高分子量的LGP(H-LGP)。上清液用旋轉蒸發儀于40℃濃縮，最后將濃縮的上清和沉淀分別冷凍干燥，備用。

(2)天冬酰胺/葡萄糖(Asn/Glc)、Asn/Glc/HLGP和Asn/Glc/L-LGP反應體系的確立:準確稱取Asn 0.15 g，Glc 0.20 g，置于10 mL 的容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，調溶液pH為8.0，最后定容至10 mL，使Asn與Glc的終濃度均為0.1 mol/L。再準確稱取 Asn 0.15 g，Glc 0.20 g，各6份，分別置于6個10 mL的容量瓶中，每份加入不同濃度的HLGP或L-LGP，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，調溶液pH為8.0，最后定容至10 mL，使Asn與Glc的終濃度均為0.1 mol/L，H-LGP和L-LGP的終濃度分別為1、5 或10 mg/mL。

然后將配好的待反應溶液分別加入耐高壓玻璃管中，將耐壓玻璃管密閉并置于油浴鍋中，分別于150℃下加熱30 min。反應結束后迅速將玻璃管放入冰水混合浴中終止反應。

1.2.2 HPLC-UV分析條件

采用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)測定反應體系中的丙烯酰胺含量，色譜操作條件為:色譜柱Thermo Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 mm)，保護柱C18(13 mm×4.0 mm，5 mm)，流動相V(甲醇)∶V(水)=3∶97，等濃度洗脫，流速 0.7 mL/min，柱溫為室溫(25℃)，進樣量20 mL，紫外檢測器，波長204 nm。

1.2.3 反應體系褐變程度的測定

反應體系的褐變程度用反應產物在450 nm處的吸光值(OD450)表示。取加熱過的各反應產物，稀釋5倍，加入到96孔培養板，每孔100 μL，每個反應產物設3個復孔，用680型酶標儀測定各反應產物OD450。

1.2.4 反應體系抗氧化性的測定

1.2.4.1 ABTS法

取各反應產物100 μL，用去離子水稀釋10倍，測定其對自由基ABTS的清除率。具體方法如下:取稀釋過的反應產物10 μL，加入90 μL的ABTS溶液，混勻，閉光放置1 min～6 min后，于630 nm處測定吸光值。用PBS代替反應產物作為對照組［10］。

1.2.4.2 DPPH法

取各反應產物200 μL，用去離子水稀釋5倍，測定其對自由基DPPH的清除率。具體方法如下:用無水乙醇配制1.52×10-4mol/L的DPPH溶液。測定時取稀釋過的反應產物15 μL，加入60 μL濃度為0.5 mol/L的Tris-HCl溶液，再加入150 μL配制好的DPPH溶液，室溫閉光放置30 min，然后于520 nm處測定吸光值。用PBS代替反應產物作為對照［8］。

1.2.5 統計分析

每個試驗重復3次，每個測定3次，結果表示為Means±SD。采用MINITAB 13.20軟件進行One-way ANOVA分析。鄧肯氏多重檢驗用來確定數據間的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 LGP對Asn/Glc反應體系中丙烯酰胺生成的影響

圖1顯示了LGP對Asn/Glc反應體系中丙烯酰胺生成的影響。

圖1 H-LGP和L-LGP對Asn/Glc反應體系中丙烯酰胺生成的影響Fig.1 Effects of H-LGP and L-LGP on acrylamide formation in the Asn/Glc model system

高、低分子質量的賴氨酸/葡萄糖美拉德反應產物(H-LGP和L-LGP)都對體系中丙烯酰胺的生成有顯著的抑制作用，添加物的濃度越高，抑制率也越強。當添加1、5、10 mg/mL的H-LGP時，對Asn/Glc體系中丙烯酰胺生成的抑制率分別為12.3%、23.4%、32.0%;添加 1、5、10 mg/mL 的 L-LGP 時，對丙烯酰胺的抑制率分別為7.3%、16.9%、31.4%。可以看出，H-LGP對丙烯酰胺的抑制作用略強于L-LGP，當添加量都為10 mg/mL時，二者無差異。

美拉德反應十分復雜，反應過程分為初期、中期和末期3個階段，在加熱食品中已檢測到的、結構明確的與美拉德反應有關的產物約有800多種，很多產物具有一定的生物活性，產物中某些產物可能對丙烯酰胺的生成有抑制作用［4］。本實驗的研究結果也表明H-LGP和L-LGP對Asn/Glc反應體系中丙烯酰胺的生成有顯著的抑制作用。

H-LGP和L-LGP具有很好的抗氧化性，能夠阻止亞油酸乳化體系中脂質過氧化，能夠清除DPPH自由基和氧自由基［8］。已有研究表明，在Asn/Glc模式體系和食品體系中添加抗氧化劑柚皮素、原花青素和生物黃酮均能有效抑制丙烯酰胺的形成［6，11-13］，生物黃酮對丙烯酰胺的抑制作用與體系的抗氧化性變化之間存在顯著的相關性。因此，推測LGP對Asn/Glc反應體系中丙烯酰胺生成的抑制作用可能與LGP的抗氧化性有一定的相關性，抑制機理有待于更深入的研究。

2.2 LGP對Asn/Glc反應體系褐變程度的影響

如圖2所示，對照組Asn/Glc體系于150℃下加熱30 min后，體系的褐變程度顯著增加，OD450達到0.75。

圖2 H-LGP和L-LGP對Asn/Glc反應體系吸光值的影響Fig.2 Effects of H-LGP and L-LGP on Absorbance of Asn/Glc model system

分別添加低、中濃度的H-LGP和L-LGP后，Asn/Glc/LGP體系的OD450在0.7～0.8之間，和對照組相比無顯著差異，說明低、中濃度的LGP對Asn/Glc反應體系的褐變無影響。當添加高濃度的LGP，整個反應體系的OD450顯著增加，且在加熱的過程中它們的顏色會隨反應時間的延長而逐漸加深［14］。整個體系的褐變程度增加，原因可能有以下3方面:(1)H-LGP和L-LGP溶液本身呈褐色，濃度越高，溶液的顏色也越深，添加高濃度的LGP后，加熱前整個體系的顏色就偏淺黃色;經150℃下加熱30 min后，由于LGP中還含有未反應完全的Lys和Glc，二者可繼續發生美拉德反應，產生褐色的產物;(2)體系中的Asn和Glc同時也在高溫加熱過程中發生美拉德反應，不僅生成了丙烯酰胺，還生成了其他褐色的產物;(3)LGP參與了體系的反應，使整個體系的顏色加深，褐變程度顯著高于對照組。

2.3 LGP對Asn/Glc反應體系抗氧化性的影響

各反應體系的抗氧化性用反應產物對自由基DPPH和ABTS的清除率來表示。

H-LGP和L-LGP對Asn/Glc體系的DPPH自由基清除率的影響如圖3所示。分別將H-LGP和LLGP加到 Asn/Glc體系中加熱30 min后，只有10 mg/mL的H-LGP和L-LGP增強了整個反應體系對DPPH自由基的清除率，和對照組相比，清除率分別提高了17.7%和9.2%;中、低濃度的2種LGP和對照相比無顯著差異。

圖3 H-LGP和L-LGP對Asn/Glc體系DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of H-LGP and L-LGP on DPPH scavenging rate in the Asn/Glc model system

H-LGP和L-LGP對Asn/Glc體系的ABTS自由基清除率的影響如圖4所示。3個濃度的LGP均顯著提高了反應體系對ABTS自由基的清除率。同一組中，1 mg/mL和5 mg/mL的濃度組之間無差異，而10 mg/mL的濃度組對ABTS的清除率不僅顯著高于對照組，還顯著高于1 mg/mL和5 mg/mL的濃度組。和對照組相比，添加H-LGP和L-LGP后整個體系對ABTS的最大清除率分別提高了29.0%和22.3%，HLGP的ABTS自由基清除率略高于L-LGP。

圖4 H-LGP和L-LGP對Asn/Glc體系ABTS自由基清除率的影響Fig.4 Effects of H-LGP and L-LGP on ABTS scavenging rate in the Asn/Glc model system

研究表明，美拉德反應產物(MRPs)中的類黑素、還原酮以及一些含N、S的雜環化合物具有一定的抗氧化活性，其中類黑素被認為是主要的抗氧化成分，具有較強的抗ABTS自由基能力，大分子質量的類黑素能夠抑制還原型輔酶Ⅱ和谷胱甘肽-S-轉移酶的活性，而小分子量的類黑素則可抑制還原型輔酶Ⅱ的活性。除此之外，在谷物油中添加類黑素也能明顯降低其過氧化值［15］。本試驗也表明賴氨酸/葡萄糖美拉德反應產物具有一定的抗氧化活性，添加到反應體系中能夠增強體系的抗氧化活性。

3 結論

LGP(1、5、10 mg/mL)對 Asn/Glc 模式反應體系中丙烯酰胺的生成有顯著的抑制作用，且濃度越大，對丙烯酰胺生成的抑制作用越強。低、中濃度的LGP對Asn/Glc體系的褐變程度無影響，但高濃度的LGP則促進了Asn/Glc體系的褐變程度。低、中、高濃度的LGP均顯著促進了Asn/Glc體系對ABTS自由基的清除作用，而對DPPH自由基的清除作用中，只有高濃度的L-LGP有顯著的促進作用。H-LGP和LLGP相比較，二者對Asn/Glc反應體系中丙烯酰胺的生成、對體系的褐變及抗氧化性的影響均無顯著差異。

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