海洋細菌發酵液快速預處理工藝*

廖云莉，夏金梅，劉榮麗，許建中，徐洵，許晨

1(廈門大學 生命科學學院，福建廈門，361102)

2(國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門，361005)3(福建中醫藥大學，福建福州，360122)

海洋微生物生存于高壓、缺氧、避光、低溫、貧營養的特殊生境，產生的代謝產物具有化學結構多樣性和生物活性多樣性［1］。我國2008年啟動海洋微生物資源的戰略性勘探與挖掘，目前，中國海洋微生物菌種保藏管理中心已經收集保藏了10萬余株海洋微生物菌種，為新化合物的發現提供了重要資源保障。開發利用海洋微生物資源，重要的途徑之一是大批量規模發酵海洋微生物，高通量分離制備其小分子代謝產物以供藥物活性篩選，增加發現活性化合物和藥物先導化合物的可能性。

微生物發酵液組成非常復雜，通常情況下，發酵液中目標物濃度很低，同時存在大量菌體細胞、培養基及其水解產物、金屬離子、生成的蛋白質和多糖等膠狀物、色素等，嚴重干擾海洋微生物小分子代謝產物的獲取與制備。因此，需要對發酵液進行適當的預處理以除去絕大多數的干擾物質，從而高效獲取目標產物［2-3］。發酵液的預處理方法多種多樣，分別適用于不同場合，其中絮凝除雜的方法操作簡便易行、能耗低、所用設備及藥劑成本低廉、易于與離心分離和膜分離等其它方法耦合使用，是工業上提取某單一目標產物常用的發酵液預處理方法［4］。目前，針對大批量不同的海洋微生物發酵液體系，以獲取全組分小分子代謝產物為目的的發酵液的預處理方法尚未見文獻報道，建立一種通用的、高效的、快捷的、能預處理大批量大體積海洋微生物發酵液的方法，對高通量分離制備小分子代謝產物具有重要意義。

由于細菌菌體極小，固液分離十分困難，本實驗采用絮凝技術使菌體聚集，增大懸浮顆粒體積，以提高過濾速率和濾液質量。配合后續提取分離，以蛋白和多糖的去除率、小分子代謝產物的保留量為指標，篩選和確定了一種絮凝耦合膜超濾處理發酵液的方法，建立了能適用于大多數不同海洋細菌發酵液的快速預處理工藝，為高通量制備海洋微生物小分子代謝產物，構建海洋微生物代謝產物餾分庫奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Al2(SO4)3·18H2O、Fe2(SO4)3、CaCl2、Na2HPO4·12H2O(分析純)，西隴化工股份有限公司;陰離子聚丙烯酰胺(CPAM)、陽離子聚丙烯酰胺(PAM)(分子質量≥300萬)，北京康普匯維科技有限公司;聚合氯化鋁、殼聚糖(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙酸乙酯(分析純)，汕頭市達濠精細化學品有限公司;甲醇(色譜純)，美國SPECTRUM CHEMICAL MFG.COPR。

1.2 儀器設備

圓形平板超濾膜(平均孔徑30 nm)，廈門新世膜環保科技有限公司;UV-9100型紫外-分光光度計，北京北分天普儀器技術有限公司;GL-21M高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司;GQ75高速管式離心機，上海浦東天本離心機械有限公司;旋轉蒸發儀RE-52A，上海亞榮生化儀器廠;Waters(Model 510)液相色譜儀，美國Waters公司;電感耦合等離子體質譜儀(icp-ms7500ce)，安捷倫公司;JA4103電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 絮凝實驗［5］

取100 mL發酵液于250 mL燒杯中，加入一定量的絮凝劑，快速攪拌30 s后再慢速攪拌2 min，調節pH值至6，靜置30 min后取上清液用濾紙過濾并測定前2 min的濾液體積，計算濾速，離心后測定上清液中的蛋白質、多糖含量和透光率，根據分析結果確定合適的絮凝pH值和絮凝劑用量［6］。

1.3.2 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法［7］。

1.3.3 多糖含量測定

采用 DNS 法［8］。

1.3.4 濾速測定［9］

取發酵液絮凝后的上清液，在常壓下過0.45 μm中性濾紙，測前2 min的濾液體積，并計算濾速。

1.3.5 透光率測定［9］

取發酵液絮凝并離心后的上清液，以水為空白，在610 nm下測定透光率。

1.3.6 絮凝劑絮凝對小分子代謝產物提取的影響

取3份發酵液，每份100 mL，一份加Al2(SO4)3絮凝，一份加聚合氯化鋁絮凝，另一份不做任何處理，均采用離心法進行固液分離(8 000 r/min，10 min)。提取3份上清液中的小分子代謝產物，粗提物干燥后分別溶解定容至10 mL，取 1 mL進行HPLC檢測。同時，將離心后固形物用甲醇∶乙酸乙酯(20∶80)混合溶劑200 mL浸泡24 h后超聲30 min，離心后取上清液濃縮干燥;將干燥后的樣品分別溶解定容至10 mL，取1 mL進行HPLC檢測。

1.3.7 鋁離子殘留量測定

取2份發酵液，每份100 mL，一份用Al2(SO4)3絮凝，另一份不做任何處理，8 000 r/min離心10 min，提取上清液中的小分子代謝產物，將粗提物進行消解［10］，消解液定容于25 mL容量瓶中，采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)檢測的含量。

2 實驗結果

2.1 絮凝劑

2.1.1 不同絮凝劑去除蛋白、多糖的比較

不同絮凝劑去除蛋白和多糖的實驗結果見表1。從表中可以看出:Al2(SO4)3、聚合氯化鋁、殼聚糖的蛋白去除效率都較高，均達到80%以上，Na2HPO4、CPAM(陽離子聚丙烯酰胺)、PAM(聚丙烯酰胺)、聚合氯化鋁對多糖的去除效果較好，均達到83%以上。從透光率和濾速來看，Al2(SO4)3和聚合氯化鋁的濾速明顯高于其它絮凝劑。綜合實驗結果，Al2(SO4)3和聚合氯化鋁的蛋白、多糖除去率高，濾速快，澄清度好，符合本實驗要求。因此，考慮兼顧各種指標，后續實驗選擇Al2(SO4)3和聚合氯化鋁為絮凝劑，進行其他實驗比較。

表1 不同絮凝劑的絮凝效果Table 1 The flocculation of the different flocculants

2.1.2 絮凝劑使用對小分子代謝產物提取的影響

按1.3.6的方法分別提取Al2(SO4)3絮凝發酵液、聚合氯化鋁絮凝發酵液、未絮凝處理發酵液上清液中的次級小分子代謝產物，獲得的指紋圖譜見圖1，相應的固形物提取的小分子代謝產物指紋圖譜見圖2。從圖1可以看出，Al2(SO4)3絮凝組與未作處理組的色譜峰基本吻合，聚合氯化鋁絮凝組的色譜峰在15～25 min和40～45 min與未作處理組的色譜峰吻合度不高;從圖2可以看出，Al2(SO4)3絮凝組與未作處理組提取物的色譜峰基本重合，表明Al2(SO4)3絮凝對小分子代謝產物組成與含量基本無不利影響;而聚合氯化鋁絮凝組提取物的色譜峰在9～12.5 min段的色譜峰信號明顯降低，某些組分提取含量減少，可能聚合氯化鋁絮凝劑或絮凝產生的固型物對小分子代謝產物有吸附作用，因此，選擇Al2(SO4)3作為發酵液的絮凝劑更適宜。

2.1.3 鋁離子在粗提物中殘留量的考察

圖1 上清液粗提物的色譜圖比較Fig.1 Contrasting the chromatograms of the crude extracts from the supermatant

圖2 固形物萃取液的色譜比較圖Fig.2 Contrasting the chromatograms of the extracts from the solid content

Al2(SO4)3絮凝處理與未絮凝處理的發酵液粗提物中鋁離子含量比較結果如表2所示，從表中數據可以看出，采用Al2(SO4)3絮凝發酵液，由上清液提取的小分子代謝產物中金屬Al3+含量與未經絮凝的發酵液上清液提取的小分子代謝產物中的金屬鋁離子含量在同一數量級水平，而且沒有明顯增加，說明小分子代謝產物粗提物中金屬鋁離子的貢獻并不是來源于Al2(SO4)3絮凝劑。

表2 粗提物中的Al3+含量比較Table 2 Contrasting the Al ion content of the crude extracts

2.2 絮凝條件的確定

2.2.1 pH值對絮凝的影響

固定絮凝劑用量、溫度等其它操作條件，在4～9之間改變pH值，分別靜置30 min后取上清液測過濾速率，8 000 r/min轉速下離心5 min后取上清液測定蛋白和多糖含量、610 nm的透光率。不同pH值條件下的實驗結果如圖3所示(A、B、C、D分別表示pH對蛋白去除率、多糖去除率、透光率、濾速的影響)。從圖3-A可以看出，隨著pH值的升高，蛋白去除率降低，pH＞6時，蛋白去除率急劇下降;從圖3-B可看出，pH值變化對多糖去除率影響不大;從圖3-C可知，隨pH的增大透光率先降低，pH＞7后緩慢升高;從圖3-D可以看到，pH＜6時，隨pH升高濾速增加，pH為6～7時，隨 pH升高濾速下降，pH為7～8時，隨pH升高濾速升高，pH＞8時，隨pH升高濾速下降，濾速呈波動狀態。pH值可影響Al3+的游離狀態，Al3+含量高，蛋白質的凝聚能力強，Al(OH)3含量高，吸附絮凝能力強。低pH值時，Al3+含量高，蛋白質凝聚能力強，但Al(OH)3含量低，吸附絮凝能力弱，溶液中的細小顆粒多，因此蛋白去除率高，但濾速低;而隨pH值增大，Al3+含量降低，Al(OH)3含量增加，蛋白凝聚能力弱，吸附絮凝能力增強，因此蛋白去除率降低，濾速增加，pH進一步增大時，生成了偏鋁酸，Al3+和Al(OH)3的含量均減少，因此蛋白去除率仍下降，同時可溶性蛋白的含量升高會使濾速降低。綜合考慮，選擇絮凝pH值為6。

圖3 pH值對Al2(SO4)3絮凝效果的影響Fig.3 Effect of pH on the floccucation effect of aluminum sulfate

2.2.2 溫度對絮凝的影響

固定絮凝劑用量、pH值等其他操作條件，讓溫度在25～45℃之間變化，靜置30 min后，取上清液測過濾速率，8 000 r/min轉速下離心5 min后取上清液測定蛋白和多糖含量以及610 nm的透光率。結果如圖4所示(A、B、C、D分別表示溫度對蛋白去除率、多糖去除率、透光率、濾速的影響)。在25～45℃，隨溫度升高，蛋白多糖去除率、透光率以及濾速均略有增加，但是影響不明顯，因此，在25～45℃可以根據具體情況設定絮凝溫度。

圖4 溫度對Al2(SO4)3絮凝效果的影響Fig.4 Effect of temperature on the floccucation effect of aluminum sulfate

2.2.3 絮凝劑用量的確定

采用上述實驗確定的最適溫度和 pH，使 Al2(SO4)3用量在100～300 μg/L之間變化，其他操作條件保持一致，靜置30 min后取上清液測定過濾速率，離心后取上清液測定蛋白質和多糖含量、610 nm透光率。以蛋白去除率和透光率均大于(或等于)80%為標準確定Al2(SO4)3的用量，建立發酵液中蛋白含量與Al2(SO4)3用量的關系，結果如表3所示。從表3可以看出，細菌發酵液中蛋白含量與Al2(SO4)3用量存在一定的關聯性，即發酵液中蛋白含量較高時為達到一定的蛋白去除率所需要的Al2(SO4)3用量也較高，但蛋白質含量在一定范圍內時，Al2(SO4)3用量多，蛋白去除率反而降低。盡管如此，仍可以通過蛋白質的含量大致判斷Al2(SO4)3的用量，該結果對細菌發酵液的快速預處理可提供有效的參考。

表3 海洋細菌發酵液中蛋白含量與Al2(SO4)3用量的關系Table 3 The relation of the protein content of fermentation borth of marine bacterias and the dosage of aluminum sulfate

2.3 海洋細菌發酵液固液分離方法的探究

2.3.1 不同固液分離方法的比較

采用上述確定的實驗條件進行發酵液的絮凝，發酵液靜置30 min后，分別采用管式離心機(20 000 r/min，2.5 L/h)、臺式離心機(8 000 r/min，離心 5 min)、0.45 μm濾紙(中速)(模擬0.45 μm 的陶瓷膜過濾)、平板超濾膜(平均孔徑30 nm)進行固液分離，取上清液測定過濾速率、蛋白和多糖含量、透光率，4種固液分離方式的效果如圖5所示(A、B、C、D分別表示對蛋白去除率、多糖去除率、透光率、濾速的影響)。從圖A、B可以得知，平板超濾膜的蛋白和多糖去除效果最好，其次是管式離心;從圖C可以看出，經過平板超濾膜過濾后的濾液透光率遠大于其他3者，臺式離心與管式離心的濾液透光率相差不大，0.45 μm濾紙過濾的濾液效果透光率極低;從圖D可以看出，采用平板超濾膜過濾的濾液再次過濾紙的速率明顯高于其他3種方式，管式離心的濾液過濾紙的速度大于臺式離心的濾液過濾紙的濾速。平板超濾膜過濾的綜合效果明顯優于其他3種固液分離方式，蛋白去除率達到98.7%，多糖去除率達到82.2%，透光率達到98%，而且濾速明顯較高。細菌的細胞很小，破碎后碎片更小，采用0.45 μm的濾紙過濾時，由于膜孔較大，小顆粒粒子能進入膜孔，使膜孔被堵，同時可溶性蛋白和多糖大部分可以通過，固液分離效果差;臺式離心機適合樣品量少的發酵液的處理，且不能連續進料;管式離心機可以連續進料，但較適合固體懸浮顆粒的液體，且進料過程中泵的脈沖會破壞絮團，操作不方便，噪音大;本實驗使用的平板超濾膜平均孔徑為30nm，對小粒子有很好的截留作用，并能截留一部分可溶性蛋白和多糖，使用幾十次后膜通量變化不大，過濾時不會破壞絮團，并且操作簡單方便，安全，能耗低，膜清洗也方便，具有很大優勢。缺點是膜比較脆弱，不能耐堿，使用pH值不宜超過8。

圖5 固液分離方式的效果比較Fig.5 Contrasting the effect of the way of solid-liquid separation

2.3.2 絮凝處理對膜超濾的影響

分別取絮凝處理與未絮凝處理的發酵液2.5 L進行膜超濾，每0.5 min讀取一次濾液體積，以時間對剩余發酵液百分比作曲線，同時分別測定濾液的各項指標值。絮凝與未絮凝發酵液的過濾速率變化如圖6所示，表征絮凝與未絮凝效果的參數結果如表4所示。從圖6的速率曲線可得知，剩余85%發酵液時絮凝組與未絮凝組用時均約為1 min，相差不大;剩余60%發酵液時，絮凝組用時2.5 min，而未絮凝組用時4.5 min，絮凝組的濾速比未絮凝組快了1.8倍;剩余40%發酵液時，絮凝組用時5 min，而未絮凝組用時13.5 min，絮凝組的濾速比未絮凝組快了2.7倍。兩者的濾速前1 min內相差不大，隨后差別越來越大，因為未絮凝組發酵液中的細小菌體及其碎片堵塞了膜孔致使濾速越來越慢，膜通量越來越低，因此進行絮凝預處理后，有效減少了膜的污染，提高了過濾速率。從表4可以看出，經過絮凝后，膜過濾上清液的澄清度、蛋白去除率以及多糖去除率、濾速明顯優于未絮凝的膜過濾上清液。

圖6 絮凝與未絮凝膜超濾速率變化曲線Fig.6 Comparing with the variation of membrane ultrafitration rate of flocculation treatment and flocculation untreatment

表4 絮凝與未絮凝處理效果比較表Table 4 Effect comparion of locculation treatment and flocculation untreatment

3 結論

本實驗以蛋白和多糖去除率、透光率、濾速為指標，結合提取到的次級代謝產物的指紋圖譜，篩選出適合海洋細菌發酵液預處理用的Al2(SO4)3絮凝劑并確定了其使用條件。Al2(SO4)3作為發酵液的絮凝劑其最適pH為6，在25～35℃均可適用，對后續目標小分子產物的提取影響不大，未增加提取物中金屬鋁的殘留量，發酵液中蛋白含量在250 μg/mL以下Al2(SO4)3用量約為100 μg/L，蛋白含量在250～400 μg/mL 時 Al2(SO4)3用量約為150 μg/L，蛋白含量在400～950 μg/mL時 Al2(SO4)3用量約為200 μg/L，蛋白含量在950 ～1 440 μg/mL 時 Al2(SO4)3用量約為250 μg/L;與超濾膜法耦合，可高效快速進行固液分離，濾液澄清度好、蛋白和多糖去除率高，并具有廣譜性，適用于大部分海洋細菌發酵液的預處理。

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